Metoda Gram

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 16 iulie 2019; verificările necesită 5 modificări .

Metoda Gram  este o metodă de colorare a microorganismelor pentru cercetare, care permite diferențierea bacteriilor în funcție de proprietățile biochimice ale peretelui lor celular . Propus în 1884 de medicul danez Hans Christian Gram .

Potrivit Gram, bacteriile sunt colorate cu coloranți de anilină  - gențiană sau violet de metil etc., apoi colorantul este fixat cu o soluție de iod . După spălarea ulterioară a preparatului colorat cu alcool , acele tipuri de bacterii care se dovedesc a fi colorate în albastru și au un perete celular gros se numesc bacterii gram -pozitive , denumite Gram (+) , - spre deosebire de gram-negative (subțiri). perete celular), Gram (-) , care s-a decolorat la spălare.

După clătire cu solvent, colorația Gram adaugă un colorant roșu contrastant care colorează toate bacteriile Gram-negative în roșu sau roz. Acest lucru se datorează prezenței unei membrane exterioare care împiedică pătrunderea colorantului în celulă. Testul clasifică bacteriile în două grupe în funcție de structura peretelui celular.

Utilizare în diagnosticare

Colorația Gram are o importanță deosebită în taxonomia bacteriilor, precum și pentru diagnosticul microbiologic al bolilor infecțioase.

Formele de bacterii gram-pozitive ( cu excepția reprezentanților genului Neisseria ) și purtătoare de spori (cu excepția Coxiella burnetii ), ele colorează albastru-negru ( albastru închis ).

Multe bacterii care nu poartă spori sunt gram-negative și se pătează roșu sau roz.

Tehnica de colorare

Colorarea Gram se referă la o metodă complexă de colorare atunci când un frotiu este expus la doi coloranți, dintre care unul este principalul, iar celălalt este unul suplimentar. Pe lângă coloranți, agenții de albire sunt folosiți pentru metode complexe de colorare: alcool, acizi etc.

Pentru colorația Gram, coloranții de anilină din grupa trifenilmetan sunt mai des utilizați: gențiană, violet de metil sau violet cristal . Microorganismele gram-pozitive dau o legătură puternică cu coloranții indicați și iodul. În același timp, nu se decolorează atunci când sunt expuse la alcool, drept urmare, cu colorarea suplimentară cu fuchsin , microorganismele gram-pozitive nu schimbă culoarea violet adoptată inițial.

Microorganismele gram-negative formează un compus ușor distrus de alcool cu ​​coloranți bazici și iod . Ca urmare, microbii se decolorează și apoi se pătează cu magenta, devenind roșii.

Pregătirea materialului pentru pictură

  1. Materialul de testat este întins într-un strat subțire pe suprafața unei lame de sticlă bine degresate.
  2. Frotiul preparat este uscat la aer și fixat după uscare completă.
  3. Secțiunile histologice se prepară după metoda standard, fixând bucăți de țesut în formol și turnându-le în parafină.

Fixare

La fixare, frotiul este fixat pe suprafața lamei de sticlă și, prin urmare, în timpul colorării ulterioare a preparatului, celulele microbiene nu sunt spălate. În plus, celulele microbiene ucise se colorează mai bine decât cele vii.

Se face o distincție între metoda fizică de fixare, care se bazează pe efectul temperaturii ridicate asupra celulei microbiene, și metodele chimice, care implică utilizarea de substanțe chimice care provoacă coagularea proteinelor citoplasmatice.

Mod fizic de fixare

Lama de sticlă cu preparatul se ia cu penseta sau degetele I și II ale mâinii drepte de coaste cu o lovitură în sus și cu o mișcare lină de 2-3 ori peste partea superioară a flăcării arzătorului. Întregul proces de fixare nu trebuie să dureze mai mult de 2 secunde.

Fiabilitatea fixării este verificată prin următoarea metodă: suprafața lamei de sticlă liberă de frotiu este aplicată pe suprafața din spate a mâinii stângi. Cu fixarea corectă a frotiului, paharul trebuie să fie fierbinte, dar să nu provoace o senzație de arsură (70-80 ° C).

Metodă chimică de fixare

Pentru a fixa frotiurile , alcool metilic , acetonă , amestecul lui Nikiforov (un amestec de alcool etilic 96% și ester anestezic într-un raport de 1: 1), lichidul lui Carnoy (96% alcool etilic - 60%, cloroform  - 30%, acetic glacial acid  - 10%) ), alcool-formol (40% formol  - 5 ml, 96% alcool etilic - 95 ml). O lamă cu un frotiu uscat este scufundată într-o sticlă cu un agent de fixare timp de 10-15 minute și apoi uscată la aer. Se folosește și fixarea în perechi de formol 40% pentru câteva secunde.

Procesul de colorare a frotiurilor

  1. Unul dintre coloranții principali este turnat pe un frotiu fix timp de 2-3 minute. Pentru a evita precipitarea, pătați prin hârtie de filtru.
  2. Scurgeți vopseaua, îndepărtați cu grijă hârtia de filtru. Frotiul se umple cu soluție Lugol sau soluție de iodură Gram (o soluție apoasă de iodură de potasiu și iod cristalin în raport de 2: 1) timp de 1-2 minute până când preparatul devine negru.
  3. Soluția se scurge, frotiul este clătit cu alcool etilic la 96 ° sau acetonă , turnându-l și scurgându-l până când frotiul se decolorează și lichidul care curge este limpede (aproximativ 20-40-60 de secunde).
  4. Lamelele se spală bine în apă curentă sau distilată timp de 1-2 minute.
  5. Pentru a identifica grupul gram negativ de bacterii, preparatele sunt colorate suplimentar cu fucsină sau safranină (2-5 min).
  6. Clătiți cu apă curentă și uscați cu hârtie de filtru.

Tehnica de colorare Gram-Weigert pentru bacterii în secțiuni histologice

  1. Secțiunile deparafinate sunt aduse la apă.
  2. Se colorează timp de 20 de minute într-o soluție 1% de pararosanilină sau fuchsin bazic în acid acetic 1% (soluția de colorant este încălzită la fierbere, răcită și filtrată).
  3. Se spală în 3 schimburi de apă distilată.
  4. Se colorează timp de 5 minute în cristal violet 1% în apă distilată.
  5. Clătiți rapid în soluție de clorură de sodiu 1%.
  6. Tratat timp de 30 s într-un amestec: 1 parte iod + 2 părți iodură de potasiu + 100 părți apă distilată.
  7. Udați cu hârtie de filtru.
  8. Se diferențiază prin aplicarea unui amestec de volume egale de anilină și xilen (1-2 ml) pe tăietură; soluțiile se scurg până când norii de colorant încetează să se îndepărteze de tăietură.
  9. Se efectuează prin 3 schimbări de xilen.
  10. Închis în balsam sau orice rășină dizolvată în xilen.

Rezultat: Bacteriile Gram pozitive sunt albastru-negru, fibrina este violet, nucleii sunt roșii.

Vezi și

Literatură

In germana
  • Gram, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (germană)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
În limba engleză
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Manualul lui Bergey de bacteriologie determinativă  (engleză) . — Ed. a 9-a — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M.T.; Martinko J; Parker J. Brock Biologia microorganismelor  (nedefinit) . — ediția a 10-a. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris Microbiologie medicală  (nedefinită) . - Ed. a 4-a - McGraw Hill., 2004.
  • Aplicarea coloranților în microbiologie clinică // Biotechnic & Histochemistry, Vol. 76, Numărul 3, 01 mai 2001, pp. 119-125(7)
  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii