Clonarea fără ligare ( LIC , Ligation Independent Cloning ), în inginerie genetică , este o metodă de obținere a plasmidelor care nu utilizează reacții de restricție și ligatură.
Tehnologia clonării fără ligază reduce timpul pentru crearea de noi construcții genetice, de exemplu, pentru exprimarea unei proteine recombinante și este cea mai potrivită pentru o linie de producție de proteine cu randament ridicat. Pentru donarea fără ligatură, este necesar să se pregătească un vector LIC - o secvență de ADN liniarizată cu capete specifice lipicioase lungi de 11-14 nucleotide . Pentru a face acest lucru, molecula de vector este hidrolizată cu o enzimă de restricție la un loc, apoi tratată cu ADN polimerază de fag T4 în prezența uneia dintre nucleotide. Activitatea 3’-exonuclează a acestei enzime duce la îndepărtarea nucleotidelor de la capătul 3’ până când nucleotida prezentă în amestecul de reacție este găsită în secvență (vezi figura). Molecula vector este preparată special în așa fel încât această nucleotidă să nu apară pe ambele părți ale situsului de restricție pentru 11-14 unități. Odată ce un vector LIC a fost izolat, acesta poate fi stocat și reutilizat pentru a clona genele proteinei țintă în el. Primerii pentru PCR a acestor gene sunt aleși astfel încât, pe de o parte, să fie complementari cu începutul sau sfârșitul genei țintă și, pe de altă parte, cu regiunile lipicioase ale vectorului LIC. Apoi, după PCR, se obține o genă proteică, în care pe ambele părți există secvențe monocatenar lungi de 11-14 nucleotide, complementare vectorului. Este suficient să amestecați un astfel de produs cu un vector și să transformați celulele bacteriene competente cu amestecul pentru a obține plasmide cu gena proteinei. Astfel, clonarea fără ligatură evită mai multe etape de restricție, gelificare și ligatură, toate putând cauza eșecuri de clonare.
1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning for high throughput gene cloning and expression / R. de Jong, M. Daniels, R. Kaptein și G. Folkers // J. Struct. Funct. Genomica. - 2006. - V. 7. - P. 109–118.
2. Lee, J. Vector LIC T7 de înaltă performanță pentru introducerea de etichete poli-histidine C-terminale cu lungimi variabile fără secvențe suplimentare / J. Lee și S. Kim // Prot. Expr. Purif. - 2009. - V. 63. - P. 58–61.
3. Novy, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Novy, K. Yaeger și K. Kolb // Inovații. - 1997. - V. 5. - P. 1-3.
4. Bardóczy, V. Un set de vectori de translație in vitro independenți de ligatură pentru producția de proteine eucariote / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo și T. Mészáros // BMC Biotechnology. - 2008. - V. 8. - Nr. 32. - P. 1-7.