Analiza cu doi hibrizi este o metodă biologică moleculară care permite detectarea de înaltă precizie a interacțiunilor proteină-proteină și ADN-proteină în condiții in vivo .
Se bazează pe utilizarea factorilor de transcripție constând din domenii separabile fizic și funcțional : legare ADN ( domeniu de legare, BD ) și domeniul activator (domeniu de activare, AD ). Interacțiunea fizică a două proteine recombinante inițiază fuziunea domeniilor de transcripție „reticulate” cu acestea, activând expresia genelor reporter .
Pentru prima dată, metoda analizei cu doi hibrizi a fost descrisă și aplicată de S. Fields și O. Song în 1989 [1] când s-a studiat factorul de transcripție GAL4 la drojdia Saccharomyces cerevisiae . Cu toate acestea, de atunci principiul detectării interacțiunilor proteină-proteină folosind activatorul de transcripție GAL4 a fost adaptat pentru a crea alte metode alternative, inclusiv unele capabile să detecteze interacțiunile ADN-proteină și ADN-ADN, precum și complexe multi-proteice.
În plus, în afară de drojdie, se mai folosesc Escherichia coli [2] și celule de mamifere .
Metoda analizei cu doi hibrizi se bazează pe caracteristicile structurale ale promotorilor genei GAL care codifică proteina galactozidaza . Promotorii acestor gene constau din cutia TATA , secvența activatorului UAS și motivul de inițiere Inr . Apariția galactozei în celulă duce la modificări conformaționale ale proteinelor reglatoare , ceea ce permite proteinei Gal4p să înceapă să acționeze ca un activator asupra diverșilor promotori GAL [3] .
Activatorul de transcripție GAL4p este o proteină exprimată endogen cu lungimea de 881 a.a., care conține 2 domenii : de legare la ADN (1-147 a.a.) și activator (771-881 a.a.). În factorii naturali de transcripție, aceste domenii sunt părți ale unui singur globul proteic, dar pot fi, de asemenea, sintetizați separat, păstrând în același timp funcțiile inițiale.
Ca exemplu, descriem dispozitivul metodei clasice cu două sisteme hibride, utilizată pentru a detecta interacțiunile dintre proteine. Pentru a testa prezența interacțiunii dintre proteina A și proteina B, sunt create molecule recombinante , dintre care una este proteina A fuzionată la domeniul de legare la ADN (A-CD), iar cealaltă este proteina B fuzionată cu domeniul activator ( RĂU). În compoziția proteinelor himerice , domeniile își păstrează funcțiile. Separat, fiecare moleculă recombinantă nu este capabilă să provoace activarea transcripției , totuși, fiind în imediata apropiere, posibil datorită interacțiunii dintre proteinele A și B, funcția originală a proteinei GAL4p este recreată, iar gena reporter este activată [4]. ] [5] .
Screeningul cu două hibrine a drojdiei utilizează adesea tulpini de drojdie modificate genetic , cărora le lipsește biosinteza anumitor nutrienți (de obicei aminoacizi sau acizi nucleici ). Astfel de tulpini sunt numite auxotrofe . Când este cultivată pe medii lipsite de acești nutrienți, drojdia va muri. Apoi, două tulpini auxotrofe sunt transfectate cu plasmide în care promotorul galactozidazei reglează transcripția genei care codifică elementul de cale metabolică lipsă . O plasmidă va conține, de asemenea, gena pentru proteina A fuzionată cu SD. În acest caz, proteina A este de obicei cunoscută. A doua plasmidă va conține gena proteinei B de fuziune AD. În acest caz, proteina B poate fi fie o proteină cu o funcție necunoscută, trebuie verificată posibilitatea de legare la proteina A, fie în loc de o plasmidă cu gena proteinei de fuziune B-AD, poate exista o întreagă bibliotecă de diferite plasmide care conțin gene pentru diferite proteine fuzionate cu AD. Astfel, biblioteca de proteine este analizată pentru posibilitatea interacțiunii cu proteina A. Metodele care utilizează biblioteca presupun că doar o pereche de plasmide intră în celula studiată, astfel fiecare celulă nu produce mai mult de o proteină din bibliotecă. Apoi se încrucișează două tulpini auxotrofe [2] . În hibridul rezultat , la interacțiunea cu succes între A și B, domeniile AD și SD devin indirect legate și AD se află în imediata apropiere a locului de începere a transcripției al genei raportoare. Tulpina rezultată nu va fi auxotrofă. În absența interacțiunii, nu există transcripție, hibridul este auxotrofen. Prin urmare, interacțiunea de succes este asociată cu o schimbare a fenotipului celular .
Analiza cu două hibride nu necesită echipamente costisitoare speciale și permite analiza bibliotecilor întregi. Cu toate acestea, un dezavantaj semnificativ al acestei metode este un număr mare de rezultate fals pozitive .
Această metodă se bazează pe aceleași principii ca și sistemul cu doi hibride, cu diferența că proteinele A și B nu interacționează direct între ele. Între ele există un al treilea element - substanța X. Această substanță poate fi o moleculă de ADN sau ARN , un mic ligand organic , un inhibitor care se leagă covalent de centrul activ al enzimei . Metoda permite identificarea interacțiunilor NK -proteină, a activității enzimatice în raport cu un substrat dat , a interacțiunii unei proteine cu molecule mici [4] .
Principala diferență față de sistemul cu doi hibride „direct” de aici este că gena a cărei expresie este reglată de acest sistem este letală. Astfel, dacă există o interacțiune între proteinele A și B, organismul hibrid va muri. Această metodă este utilizată pentru determinarea reziduurilor de aminoacizi necesare interacțiunii dintre globulele A și B [4] .
În această modificare a metodei clasice, există o singură moleculă recombinantă, AD-A-B-SD. În acest caz, o secvență de ADN cunoscută este inserată înaintea genei reporter , BD variază. În acest fel, este posibil să se determine care proteine se leagă la o anumită secvență de ADN [4] .
Se presupune că orice celulă vie poate fi utilizată pentru a implementa un sistem cu doi hibride, cu toate acestea, există considerații practice despre costul scăzut și stabilitatea liniei celulare selectate [6] .
Din punct de vedere istoric, primul organism pentru un sistem cu doi hibrizi este drojdia . Drojdia este un organism model stabil, simplu și bine studiat . Celulele de drojdie mențin valori neutre ale pH -ului în interiorul celulei, în ciuda valorilor pH-ului acide din mediul extern. Drojdiile sunt, de asemenea, slab sensibile la toxinele extracelulare, ele pot fi manipulate fără a folosi metode moleculare [7] Este important de remarcat necesitatea semnalelor de localizare nucleară , deoarece întregul aparat genetic al drojdiei este localizat în nucleu. În absența lor, o pereche de proteine care poate interacționa nu va fi tradusă și nu va interacționa.
Sistemele bacteriene pot fi utilizate similar sistemelor cu drojdie. Ele au, evident, mai mult potențial și sunt mai preferabile pentru utilizarea unui sistem cu două hibride. Sistemele bacteriene permit utilizarea și analiza bibliotecilor mai mari de 108 , au o rată de creștere mai rapidă și un potențial mai mare pentru permeabilitatea moleculelor mici. De asemenea, nu este nevoie de semnale de localizare nucleară și devine posibil să se studieze proteinele care sunt toxice pentru drojdie. Datorită metodelor selective mai rapide, se asigură o rată scăzută de fals pozitivi (3·10 −8 ) [6] .
Când se studiază interacțiunea proteinelor, este posibil să se identifice noi funcții. Folosind o proteină A0 cunoscută , o bibliotecă de proteine Bn necunoscute și o comparație ulterioară cu o pereche cunoscută anterior de proteine care interacționează A0B0 , se pot obține informații despre similitudinea dintre Bn și B0 . Date similare pot fi obținute prin studierea interacțiunilor unei biblioteci cunoscute de proteine cu o singură proteină cu o funcție necunoscută [7] .
Sistemul cu doi hibride este utilizat atunci când pentru o pereche de proteine cunoscute și care interacționează este necesar să se determine reziduurile de aminoacizi care formează zona de interacțiune a acestora. Pentru a face acest lucru , în plasmidele utilizate sunt efectuate mutații în perechile de baze ADN corespunzătoare unor aminoacizi specifici . Astfel, se formează o bibliotecă cu modificări punctuale ale reziduurilor de aminoacizi, pe baza căreia, folosind un sistem bihibrid, este posibil să se determine importanța unui anumit aminoacid în formarea interacțiunii cu o proteină parteneră [7] ] .
Metodele moderne fac posibilă construirea unei celule alese pentru studiu în așa fel încât să reflecte unul sau altul aspect molecular ales pentru studiu. În astfel de celule, devine posibil să se testeze specificitatea și acuratețea administrării medicamentelor mediate de sistemul cu doi hibride, permițându-vă să rezolvați rapid problemele efectelor secundare emergente.
O abordare similară este utilizată pentru toxine și otrăvuri [7] .
Pentru a căuta proteine degete de zinc (proteine degete de zinc sau ZFP), au fost aplicate cu succes metode bazate pe analiza cu doi hibridi [2] . Ca proteină de legare a ADN-ului, ZFP este utilizată pentru a crea domenii non-standard de legare a ADN-ului care se coordonează cu o regiune predeterminată a secvenței ADN.
Metoda se bazează pe crearea unei biblioteci ZFP prin modificarea aleatorie a anumitor reziduuri de aminoacizi. Mai mult, cei care sunt capabili să interacționeze cu site-ul țintă inclus în UAS sunt selectați dintre ele, corespunzător caracteristicilor necesare. Cu toate acestea, fiecare ZFP recunoaște doar o mică întindere de ADN, aproximativ 3-4 baze, astfel încât un complex format din două ZFP cu o secvență constantă este utilizat pentru a îmbunătăți acuratețea legării și pentru a preveni recunoașterea site-urilor din afara UAS . ZFP dintr-un astfel de complex se leagă la marginile zonei țintă și împiedică legarea în afara UAS [2] .
Un număr de alte domenii de legare la ADN pot fi, de asemenea, investigate folosind acest sistem.