Microscop laser cu doi fotoni - un microscop laser care vă permite să observați țesuturile vii la o adâncime mai mare de un milimetru, folosind fenomenul de fluorescență . Un microscop cu doi fotoni este un tip de microscop cu fluorescență multifotoni . Avantajele sale față de un microscop confocal sunt puterea sa mare de penetrare și fototoxicitatea scăzută [1] .
Microscopul cu doi fotoni a fost construit pentru prima dată de Winfred Denk în laboratorul lui W. W. Webb de la Universitatea Cornell [2] . El a combinat ideea excitației cu doi fotoni cu scanarea laser.
Microscopul laser cu doi fotoni se bazează pe principiul fizic descris de Maria Goeppert-Mayer în teza sa de doctorat [3] în 1931.
Procesul de excitare cu doi fotoni are loc după cum urmează: doi fotoni cu energie scăzută excită un fluorofor (o moleculă sau o parte a unei molecule capabile de fluorescență) în timpul unui eveniment cuantic. Rezultatul acestei excitații este emisia ulterioară a unui foton fluorescent de către moleculele excitate. Energia fotonului fluorescent este mai mare decât energia fotonilor excitanți.
Probabilitatea ca ambii fotoni de excitație să fie absorbiți de o moleculă este foarte mică. Prin urmare, este necesar un flux mare de fotoni excitanți, care poate fi obținut folosind un laser care emite fotoni cu o rată mare de repetiție a impulsurilor (80 MHz). Cele mai frecvent utilizate fluorofori au un spectru de excitație în intervalul 400-500 nm, în timp ce lungimea de undă a laserului de excitație este în intervalul 700-1000 nm (regiune infraroșu). Dacă fluoroforul absoarbe doi fotoni în același timp, atunci va primi suficientă energie pentru a intra într-o stare excitată. Apoi, fluoroforul excitat va emite un foton (în partea vizibilă a spectrului), a cărui lungime de undă depinde de tipul de fluorofor.
Deoarece absorbția a doi fotoni este necesară pentru ca fluoroforul să intre în starea excitată, probabilitatea ca fluoroforul să emită un foton secundar este proporțională cu pătratul intensității excitației. Prin urmare, fluorescența va fi mai puternică atunci când fasciculul laser este clar focalizat și nu împrăștiat. Fluorescența maximă se observă în volumul focal (volumul în care este focalizat fasciculul laser) și arată o scădere bruscă în regiunea nefocalizată.
Într-un microscop cu doi fotoni, un fascicul laser în infraroșu este focalizat folosind o lentilă obiectiv convergentă . În mod obișnuit, se folosește un laser cu safir de înaltă frecvență de 80 MHz, care emite un impuls de 100 femtosecunde, oferind densitatea mare a fluxului de fotoni necesară pentru absorbția de doi fotoni.
Lumina emisă de o probă fluorescentă este amplificată folosind un tub fotomultiplicator foarte sensibil . Deoarece receptorul de lumină este cu un singur canal, intensitatea luminii observată într-un anumit volum focal formează un pixel de imagine . Pentru a obține o imagine bidimensională a pixelilor, scanarea se realizează în planul focal al probei.
Utilizarea luminii infraroșii pentru a excita fluoroforul în țesuturile studiate are avantajele sale [4] :
Dar există și câteva dezavantaje: