Imunoprecipitarea este o metodă de izolare a unei proteine din amestecuri complexe, cum ar fi lizate de celule , seruri și omogenate de țesut , folosind anticorpi specifici proteinei . Imunoprecipitarea face posibilă detectarea modificărilor expresiei proteinelor , caracterizarea proteinelor cu care proteina studiată formează un complex, identificarea situsurilor de legare a proteinelor cu acizii nucleici [1] .
Când se efectuează imunoprecipitarea, anticorpii se leagă de microbile. Cele mai frecvent utilizate microbile sunt fabricate din agaroză . De asemenea, pot fi utilizate microbile cu proprietăți magnetice. Cu ajutorul unui magnet , microbilele magnetice care poartă complexe antigen-anticorp pot fi păstrate în eprubetă în timp ce componentele probei care nu s-au legat de anticorp sunt îndepărtate din aceasta [1] .
În funcție de metoda de legare a anticorpilor pe microbile, există trei tehnologii de imunoprecipitare. Tehnologia clasică folosește microbile acoperite cu proteina A sau proteina G. Proteina A, ca și proteina G, se poate lega de regiunea Fc a unei mari varietăți de anticorpi. Un anticorp specific pentru proteina de izolat este incubat cu amestecul din care proteina urmează să fie izolată. După ce se formează complexul proteinei secretate ( antigen ) cu anticorpul, în amestec sunt introduse microbile acoperite cu proteina A sau proteina G. Complexele antigen-anticorp se leagă de microbile. Utilizând centrifugare și spălare, microbilele cu complexe antigen-anticorp asociate sunt separate din amestec. Antigenul și anticorpul sunt eluați din microbile. Uneori, la amestec se adaugă microbile, la care anticorpii au fost legați anterior. Principalul dezavantaj al tehnologiei clasice este că eluția proteinei izolate din microparticulă va elimina și anticorpul din microparticulă. Ca urmare, proteina izolată va fi contaminată și anticorpii nu pot fi reutilizați [1] .
Contaminarea proteinei izolate și pierderea anticorpilor pot fi evitate prin imobilizarea anticorpilor pe microparticulă. Există două tehnologii: imobilizarea prin reticulare covalentă a anticorpului și proteinei A sau proteinei G situate pe suprafața microparticulei și imobilizarea datorită formării unei legături covalente între anticorp și materialul microparticulei. Aceste tehnologii au și dezavantajele lor. Un dezavantaj al legăturii covalente a unui anticorp la proteina A sau proteina G este că reactivul de reticulare poate forma legături covalente la locurile arbitrare ale anticorpului, dăunând situsului activ și, ca rezultat, anticorpul își pierde capacitatea de a lega antigenul. Dezavantajul legării covalente a anticorpului și a materialului microparticulelor este că, spre deosebire de tehnologiile proteinei A sau proteinei G, o regiune arbitrară a anticorpului se va lega de microparticulă, ceea ce poate duce la pierderea capacității anticorpului de a lega antigenul. [1] .
Într-o situație în care anticorpii la o proteină izolată nu sunt disponibili, o etichetă poate fi cusută utilizând metode de inginerie genetică (de exemplu, o etichetă FLAG ), la care sunt disponibili anticorpi [2] .
Avantajele imunoprecipitării includ faptul că în această metodă antigenele interacționează cu anticorpii în conformația lor nativă pentru separare ulterioară și analiză cantitativă. Mai mult, metoda de imunoprecipitare vă permite să concentrați proteina. Dezavantajul metodei este că pentru o detecție eficientă, proteina trebuie să fie marcată radioactiv [3] .
Co-imunoprecipitarea (Co-IP) este imunoprecipitarea unui întreg complex de proteine , care se bazează pe utilizarea unui anticorp specific pentru una dintre proteinele care alcătuiesc complexul. Prin legarea acestei proteine, anticorpul leagă întregul complex. Ca urmare, devine posibilă identificarea tuturor proteinelor care alcătuiesc complexul [1] .
Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) este o metodă pentru găsirea locurilor de legare ale proteinei de legare la ADN studiate în genom . Pentru a face acest lucru, ADN-ul este izolat din celulă și tăiat în fragmente mici, iar apoi imunoprecipitarea este efectuată folosind anticorpi la proteina de legare la ADN studiată. Ca rezultat, complexele constând din proteina de legare la ADN studiată și un fragment de ADN se leagă de anticorpi . Astfel de fragmente de ADN sunt locurile de legare ale proteinei de legare ADN studiate în genom. Pentru a citi secvența de nucleotide a acestor fragmente de ADN, se folosesc microarrays ADN (ChIP-on-chip) sau metode moderne de secvențiere (ChIP-seq) [4] [5] .
Imunoprecipitarea ARN (RIP) este o metodă care vă permite să identificați moleculele de ARN care interacționează cu proteina de legare a ARN-ului studiată și să determinați situsurile de legare ale proteinei studiate cu moleculele de ARN. Procedura pentru imunoprecipitarea ARN este similară cu imunoprecipitarea cromatinei . Pentru a citi secvența de nucleotide a fragmentelor de ARN izolate, se folosesc micromatrice ADN, care au obținut în prealabil molecule de ADN complementare fragmentelor selectate (RIP-chip), sau metode moderne de secvențiere (RIP-seq) [6] .