Metoda cometei ADN

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 22 august 2020; verificarea necesită 1 editare . Aspectul și clasarea cometelor ADN:
Cinci tipuri condiționate de comete ADN care sunt luate în considerare atunci când se analizează gradul de deteriorare a ADN-ului

Metoda cometei ADN  este o metodă pentru detectarea leziunilor ADN și studierea reparării la nivelul celulelor individuale. Metoda este capabilă să detecteze rupturile catenei de ADN în celule individuale. Este rapid și foarte sensibil [1] .

Istorie

Lucrarea lui Rydberg și Johanson (1978) [2] este considerată a fi prima experiență de succes în studierea leziunilor ADN-ului în celule individuale . Ulterior, metoda a fost modificată și îmbunătățită în mod repetat pentru a o simplifica și a crește sensibilitatea detectării deteriorării ADN-ului celular [2] .

Aplicabilitate

Metoda cometei ADN este aplicabilă atât în ​​sistemele in vivo , cât și în cele in vitro . În prezent, metoda este utilizată pe scară largă în studiile de genotoxicitate a radiațiilor ionizante , produse farmaceutice și chimice industriale, repararea ADN-ului, apoptoză, studii clinice privind diagnosticul prenatal, susceptibilitatea cancerului, terapia cancerului, cataractei. Această metodă devine treptat parte integrantă a programelor de biomonitorizare:

Utilizarea metodei face posibilă luarea în considerare a eterogenității populațiilor complexe, studierea randamentului deteriorării ADN-ului și repararea în aproape orice celule eucariote. În același timp, pentru analiză sunt necesare doar câteva mii de celule din proba de testat [1] [3] .

Declarație de metodă

Imobilizarea celulelor expuse la factorul studiat se realizează în agaroză cu punct de topire scăzut depus pe o lamă de sticlă pentru microscopie. Tratarea probelor în tampon cu conținut ridicat de sare duce la liza membranelor celulare și la extracția proteinelor. Moleculele de ADN sunt separate prin electroforeză, urmele de ADN sunt vizualizate prin colorare cu un colorant fluorescent, după care probele sunt examinate la microscop. În prezența ruperii ADN-ului, organizarea structurală a cromatinei este perturbată și se pierde supraînvăluirea ADN-ului, ceea ce duce la relaxarea acestei biomacromolecule și se formează fragmente de ADN care nu sunt asociate cu celula. Într-un câmp electric, buclele relaxate și fragmentele de ADN sunt întinse spre anod, ceea ce conferă obiectelor observate aspectul de „comete” (de unde și denumirea de „ test de cometă ”, care a devenit obișnuit). Cantitatea de ADN care migrează spre anod și determinată de un microfotometru poate fi utilizată ca indicator care caracterizează nivelul de deteriorare a ADN-ului în celulele studiate. „Cometele” sunt analizate fie prin observarea vizuală și diferențierea „cometelor” în funcție de gradul de deteriorare a ADN-ului, fie folosind software-ul computerizat de procesare a imaginilor. Această din urmă metodă de analiză a „cometelor” este necesară în special pentru o evaluare obiectivă a efectului unei concentrații mici a unui agent dăunător, sau pentru a identifica diferențe minore între subpopulațiile celulare [1] .

Standardizarea metodei

În prezent, majoritatea laboratoarelor care au implementat această abordare metodologică în cercetare au dezvoltat numeroase variații ale protocolului, în special, durata și condițiile de liză celulară, denaturare, electroforeză și colorare ADN. 25-500 de celule sunt numărate pe un pahar în duplicat. Rezultatele experimentului sunt de încredere atunci când sunt repetate de cel puțin 6 ori. Analiza cometelor ADN poate fi efectuată vizual sau folosind un complex software și hardware. În analiza vizuală, cometele ADN sunt clasificate în cinci tipuri condiționate cu valoarea numerică corespunzătoare de la 0 la 4.

Calculul indicilor

Desemnare Caracteristică Calcul

Indexul cometei ADN (indice al cometei ADN)

 — Gradul de deteriorare a ADN-ului Indicele cometelor ADN  este calculată
ca raportul dintre suma „cometelor ADN” de fiecare tip
și suma totală a „cometelor ADN” numărate.
, unde  este numărul de „comete ADN” de fiecare tip și  - suma "ADN-cometelor" numărate.

Programe de imagistică și analiză

Vezi și

Note

  1. ↑ 1 2 3 Sorochinskaya, Mihailenko, 2008 , p. 303-309.
  2. ↑ 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. Estimarea rupurilor catenei de ADN în celulele de mamifer unice // Academic Press. - New York, 1978. - S. 465-468 .
  3. ↑ S. Cotelle și JF Ferard. Testul cometelor în ecotoxicologie genetică: o revizuire  // Mutageneză de mediu și moleculară. - Wiley-Liss, 1999. - T. 34 . - S.: 246-25 . Arhivat din original pe 4 martie 2016.

Literatură