Southern blot

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită la 22 februarie 2022; verificarea necesită 1 editare .

Southern blot [1] , Southern blot [2] , Southern blot [2] , Southern blot [3] , Southern blot [3] , Southern blot [4] , Southern blot [3] (din engleză.  Southern blot ) este un metodă utilizată în biologia moleculară pentru a identifica o anumită secvență de ADN dintr-o probă. Constă în transferarea fragmentelor de ADN separate prin electroforeză într-un gel de agaroză într-un filtru de membrană și, ulterior, detectarea unei secvențe cunoscute dintr-o sondă de ADN în ele prin hibridizare cu aceasta. Metoda poartă numele inventatorului, biologul englez Edwin Southern [5] .

Alte tehnologii de transfer prin blot, cum ar fi Western blot , Northern blot , Southwestern blot , folosesc metode similare, dar pentru a detecta ARN sau proteine ​​într-o probă și sunt denumite după metoda inventată de Southern.

Metoda

  1. Endonucleaze de restricție (enzime de restricție) pentru a tăia ADN -ul cu greutate moleculară mare în fragmente mai mici.
  2. Fragmentele de ADN sunt supuse electroforezei pe gel de agaroză pentru separarea lungimii.
  3. Dacă există fragmente de ADN mai lungi de 15 kb . , gelul este tratat cu, de exemplu, acid clorhidric înainte de transfer . Acest lucru face ca fragmentele de ADN să fie depurinate, descompunându-le în bucăți mai mici, ceea ce facilitează transferul ulterior pe membrană.
  4. În cazul în care se utilizează metoda de transfer alcalin, gelul de agaroză este plasat într-o soluție alcalină , care denaturează dubla helix ADN și facilitează legarea ADN-ului încărcat negativ de membrana încărcată pozitiv pentru hibridizare ulterioară. În același timp, reziduurile de ARN sunt de asemenea distruse .
  5. O foaie de membrană de nitroceluloză (sau nailon ) este plasată deasupra sau sub gelul de agaroză. Presiunea se aplică direct pe gel sau prin mai multe straturi de hârtie. Pentru un transfer de succes, este necesar un contact strâns între gel și membrană. Tamponul este transferat prin forțe capilare dintr-o zonă cu potențial de umiditate ridicat într-o zonă cu potențial de umiditate scăzut (membrană). În acest caz, ADN-ul este transferat din gel în membrană. ADN-ul polianionic se leagă de o membrană încărcată pozitiv prin forțele interacțiunilor schimbătoare de ioni.
  6. Pentru fixarea finală a ADN-ului pe membrană, aceasta din urmă este încălzită într-un cuptor convențional sau cu vid la o temperatură de 80 °C timp de două ore sau iluminată cu radiații ultraviolete (în cazul membranelor de nailon).
  7. Se efectuează hibridizarea unei sonde ADN marcate radioactiv sau fluorescent având o secvență de ADN predeterminată cu o membrană.
  8. După hibridizare, excesul de sondă de ADN este spălat de pe membrană și modelul de hibridizare este vizualizat pe film cu raze X prin autoradiografie (în cazul unei sonde radioactive) sau se evaluează colorarea membranei (în cazul colorației cromogenice) .

Rezultate

Hibridizarea sondei cu un fragment specific de ADN pe membrana filtrului indică faptul că acest fragment conține o secvență de ADN complementară secvenței de nucleotide a sondei.

Aplicație

Southern blotting, care se efectuează pe ADN genomic tratat cu endonucleaze de restricție , poate fi utilizată pentru a determina numărul de copii ale genelor din genom. O sondă care hibridizează doar la un singur fragment de ADN care nu a fost tăiat cu enzime de restricție produce o singură bandă pe un Southern blot, în timp ce mai multe benzi pe un blot indică faptul că sonda s-a hibridizat la mai multe secvențe identice. Modificările condițiilor de hibridizare (creșterea temperaturii la care se realizează hibridizarea, modificarea concentrației de sare) duc la o creștere a specificității și o scădere a hibridizării cu secvențe similare, dar nu identice.

Note

  1. ↑ Hare R. G. , Butvilovsky V. E. , Davydov V. V. , Rachkovskaya I. V. . 7.2.2 Analiza fragmentelor de ADN  // Biologie medicală și genetică generală: manual. — Ed. a II-a, corectată. - Minsk: Școala superioară, 2012. - S. 100. - 496 p. - ISBN 978-985-06-2182-5 .
  2. ↑ 1 2 Arefiev V. A. , Lisovenko L. A. . Southern-blotting, Southern-transfer  // Dicționar explicativ englez-rus al termenilor genetici / științific. ed. L. I. Patrushev. - M. , 1995. - ISBN 5-85382-132-6 .
  3. ↑ 1 2 3 blot of Suzern  // Marele Dicționar Enciclopedic al Termenilor Medicali / ed. prof. E. G. Ulumbekova . - M.  : GEOTAR-Media, 2012. - S. 220. - 2263 p. - 2000 de exemplare.  — ISBN 978-5-9704-2010-2 .
  4. ↑ Blot: western, northern and southern blot (blot, western, northern, southern) // Dicționar epidemiologic / ed. JM Last pentru Asociația Internațională de Epidemiologie; resp. ed. ed. rusă. V.V.Vlasov . - a 4-a ed. - M.  : OIZ, 2009. - S. 28, 272. - 316 p.
  5. ↑ Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separate by gel electrophoresis // J Mol Biol.. - 1975. - doi : 10.1016 /S0022-2836(75)80083-0

Vezi și