Western blot (western blot, protein immunblot, ing. Western blot ) este o metodă analitică utilizată pentru a determina proteine specifice dintr-o probă . Primul pas folosește electroforeza proteinelor într-un gel de poliacrilamidă pentru a separa polipeptidele denaturate după lungime (de obicei în prezența SDS ) sau structura tridimensională a proteinei (în starea nativă). Apoi, proteinele sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF , apoi detectate folosind anticorpi specifici unei anumite proteine [1] [2] .
Există multe companii comerciale specializate în producerea de anticorpi (atât monoclonali , cât și policlonali ) la zeci de mii de proteine diferite [3] .
Western blotting este utilizat în biologie moleculară , biochimie , genetică și alte discipline ale științelor naturale.
Alte metode similare folosesc anticorpi pentru a detecta proteinele în țesuturi și celule prin imunocolorare și test imunosorbent legat de enzime ( ELISA ) .
Western blot a fost dezvoltat în laboratorul lui George Stark de la Stanford . Denumirea Western Blot a fost dată tehnicii de W. Neal Burnette [4] și este un joc de cuvinte din numele Southern Blot , o tehnică de detectare a ADN -ului dezvoltată anterior de Edwin Southern . O metodă similară pentru determinarea ARN se numește Northern blotting , detectarea modificărilor proteinelor post-translaționale se numește Eastern blotting .
Proba poate fi prelevată din țesut întreg sau din cultură celulară. În cele mai multe cazuri, țesuturile dure sunt mai întâi măcinate folosind un blender (pentru mostre de volum mare), un omogenizator (volume mai mici) sau sonicare . În același timp, bacteriile, virușii și alte componente ale mediului sunt, de asemenea, o sursă de proteine.
Diferiți detergenți , săruri și soluții tampon pot fi utilizați pentru a îmbunătăți liza celulară și dizolvarea proteinelor . Inhibitorii de protează și fosfatază sunt adesea adăugați pentru a preveni digerarea probelor de către propriile enzime . Pregătirea țesuturilor este adesea efectuată la temperaturi scăzute pentru a evita denaturarea proteinelor .
Combinații de tehnici de fracționare biochimică și mecanică, inclusiv diferite tipuri de filtrare și centrifugare , sunt utilizate pentru a separa diferite compartimente celulare și organele .
Proteinele sunt separate folosind electroforeza pe gel de poliacrilamidă. Separarea proteinelor se poate face prin punct izoelectric (pI), greutate moleculară , sarcină electrică sau o combinație a acestor parametri.
Cea mai comună metodă de separare a proteinelor este electroforeza în gel de poliacrilamidă în prezența dodecil sulfatului de sodiu ( SDS ) conform lui Laemmli . [5] SDS provoacă denaturarea proteinelor și le menține într-o stare denaturată; agenții de reducere a legăturilor disulfurice, cum ar fi ditiotreitolul și mercaptoetanolul , sunt utilizați pentru a distruge structurile secundare și terțiare ale proteinelor . Polipeptidele denaturate migrează în câmpul electric prin gelul de acrilamidă către anod , proteinele mai mici mișcându-se mai repede și astfel se separă în funcție de greutatea moleculară. Concentrația de acrilamidă determină rezoluția gelului - cu cât concentrația de acrilamidă este mai mare, cu atât rezoluția proteinelor cu greutate moleculară mică este mai bună. O concentrație scăzută de acrilamidă îmbunătățește rezoluția pentru proteinele cu greutate moleculară mare. De asemenea, este posibilă utilizarea electroforezei bidimensionale (2-D) . În acest caz, separarea proteinelor se realizează în două direcții - în conformitate cu punctul lor izoelectric în prima direcție și în conformitate cu greutatea moleculară - în a doua.
Probele de pe gel sunt aplicate pe buzunare. De regulă, una dintre „urme” este lăsată pentru markerii de greutate moleculară (amestecuri de proteine cu mase cunoscute). După ce se aplică tensiunea, proteinele se mișcă în câmpul electric cu viteze diferite. Diferențele în viteza de progres - mobilitatea electroforetică - duce la separarea proteinelor în benzi ( benzi engleze ).
Pentru a face proteinele disponibile pentru anticorpi și pentru detectarea ulterioară, acestea sunt transferate împreună cu o bandă de gel pe o membrană din nitroceluloză sau fluorură de poliviniliden ( PVDF ) . Membrana se aplică peste gel, iar deasupra ei se pune un teanc de hârtie de filtru. Întregul teanc este plasat în tamponul de transfer, care, sub acțiunea acțiunii capilare, mută hârtia în sus, purtând proteinele cu ea. O altă metodă de transfer al proteinelor se numește electroblotting și folosește un curent electric pentru a transfera proteinele din gel în membrană. Proteinele se deplasează din gel în membrană menținându-și locația. Ca rezultat al acestui proces de „blotting” (din engleză blotting ), proteinele sunt reținute pe un strat subțire de suprafață al membranei de detectare. Ambele variante de membrană sunt utilizate datorită proprietăților lor nespecifice de legare la proteine. Legarea proteinelor se bazează atât pe interacțiuni hidrofobe, cât și pe interacțiuni electrostatice dintre membrană și proteină. Membrana de nitroceluloză este mai ieftină decât PVDF, dar este mult mai fragilă și mai puțin rezistentă la reetichetare.
Uniformitatea și eficiența globală a transferului de proteine de la gel la membrană poate fi verificată prin colorarea membranei cu colorații de albastru Coomassie sau Ponceau S. Coomassie este cel mai comun dintre cele două, în timp ce Ponceau S este mai sensibil și mai solubil în apă, facilitând curățarea și etichetarea ulterioară a membranei. [6]
Odată ce o membrană a fost selectată pentru capacitatea sa de a lega proteinele, au fost selectați anticorpii și proteina țintă, trebuie avut grijă să se evite interacțiunea dintre membrană și anticorpul utilizat pentru a detecta proteina țintă (deoarece anticorpul în sine este o proteină). Blocarea legării nespecifice se realizează prin plasarea membranei într-o soluție proteică diluată - de obicei albumină serică bovină sau lapte uscat fără grăsimi (ambele ieftine), cu un procent mic de detergent precum Tween 20 sau Triton X-100 . Proteina din soluția diluată este atașată de membrană în toate locurile unde proteina țintă nu s-a atașat. Prin urmare, atunci când se adaugă anticorpi, singurul loc liber de pe membrană unde se pot atașa este situsurile de legare pe proteinele țintă specifice. Acest „zgomot” de fundal în western blot final are rezultate curate și eliminarea fals pozitive.
În timpul procesului de detectare, membrana este „etichetată” cu proteina de interes cu un anticorp modificat care este legat de o enzimă reporter care este menținută pe un suport adecvat, conducând la o reacție colorimetrică și dând culoare. Din diverse motive, detectarea se realizează în doi pași, deși o metodă de detectare într-un singur pas este acum disponibilă pentru anumite aplicații.
Anticorpii sunt produși prin expunerea unei clase de gazdă sau a unei culturi de celule imune la o anumită proteină (sau o parte a acesteia). Aceasta face de obicei parte din răspunsul imun, dar aici (în test) anticorpii colectați sunt utilizați ca instrument de detectare specific și sensibil care se leagă direct de proteină.
După blocare, soluția de anticorp primar diluată (de obicei între 0,5 și 5 pg/ml) este incubată cu membrana și agitată ușor. De obicei, soluția constă dintr-o soluție de sare tamponată cu un procent mic de detergent, uneori lapte praf sau BSA. Soluția de anticorp și membrana pot fi închise împreună și incubate oriunde de la 30 de minute până la peste noapte. Ele pot fi, de asemenea, incubate la diferite temperaturi; la temperaturi ridicate, se observă o legare mai bună - atât specifică (a proteinei țintă, „semnal1”), cât și nespecifică („zgomot”).
După clătirea membranei pentru a îndepărta anticorpii primari nelegați, membrana este expusă la alți anticorpi care se leagă direct la regiunile specifice clasei ale anticorpilor primari. Aceștia sunt cunoscuți ca anticorpi secundari și, în funcție de proprietățile lor țintă, sunt denumiți în mod obișnuit ca „anti-șoarece”, „anti-capră” și așa mai departe. Anticorpii sunt obținuți dintr-o sursă animală (sau surse animale de cultură de hibridom ); anticorpii secundari anti-șoarece se vor lega de majoritatea anticorpilor primari derivați de șoarece. Acest lucru creează unele economii, permițând unui laborator individual să utilizeze o singură sursă de producție în masă de anticorpi și duce la rezultate mult mai reproductibile. Anticorpii secundari sunt de obicei legați de biotină sau de o enzimă reporter , cum ar fi fosfataza alcalină sau peroxidaza de hrean . Aceasta înseamnă că mai mulți anticorpi secundari se pot lega de un primar și pot amplifica semnalul.
Cei mai obișnuiți anticorpi secundari legați de peroxidaza de hrean sunt utilizați pentru a tăia agentul chemiluminescent, iar produsul de reacție produce radiații luminiscente proporțional cu cantitatea de proteină. O foaie de film fotografic fotosensibil este plasată pe membrană și expusă la radiația de reacție, creând o imagine a benzilor de anticorpi pe pată. O abordare mai ieftină, dar mai puțin sensibilă, folosind colorant de 4-cloronaftol amestecat cu 1% peroxid de hidrogen ; reacția radicalului peroxid cu 4-cloronaftol dă o culoare maro închis, care este înregistrată fără utilizarea unui film fotografic special.
Ca și în cazul ELISPOT și ELISA , enzima poate fi prevăzută cu o moleculă de substrat care este convertită de enzimă într-un produs de reacție colorat care va fi vizibil pe membrană (vezi figura cu benzi albastre de mai jos).
O altă metodă secundară de detectare a anticorpilor utilizează anticorpi cu un fluorofor legat care emite în infraroșu apropiat (NIR). Lumina emisă de colorantul fluorescent este constantă și face ca detectarea fluorescenței să fie un mod mai precis și mai sensibil de a măsura diferența de semnal produs de proteinele marcate cu anticorpi pe un Western blot. Proteinele pot fi cuantificate deoarece semnalul este calculat ca diferența (radiația) în raport cu toate proteinele de pe membrană, măsurate în repaus, cu (radiația) chemiluminiscenței, care este măsurată dinamic. [7]
O a treia metodă alternativă utilizează o etichetă radioactivă în loc de o enzimă legată de un anticorp secundar, cum ar fi proteina de legare a anticorpilor de tip Staphylococcus Protein A marcată cu un izotop radioactiv de iod. Alte metode sunt mai sigure, mai rapide și mai ieftine, astfel încât detectarea radioactivă este rar folosită.
Din punct de vedere istoric, procesul de marcare a fost realizat în două etape, deoarece este relativ mai ușor să se producă anticorpi primari și secundari în procese separate. Acest lucru oferă cercetătorilor și companiilor un avantaj imens în ceea ce privește flexibilitatea și adaugă un pas de amplificare procesului de detectare. Având în vedere apariția testelor de proteine de mare capacitate și praguri scăzute de detecție, există încă interes în dezvoltarea unui sistem de etichetare într-un singur pas care să permită procesului să ruleze mai rapid și la costuri mai mici. Acesta (un sistem într-un singur pas) necesită etichete de anticorpi care să recunoască proteina studiată și să poarte simultan un marker pentru detectare - etichetele cele mai accesibile cunoscutelor „cozi de proteine”. Mai întâi, etichetele sunt incubate cu o membrană în stil în două etape cu anticorpi primari și apoi sunt gata pentru detectarea directă după o serie de spălări.
După spălarea etichetelor nelegate, Western blot este gata să detecteze sondele legate de proteina țintă. În practică, nu toți occidentalii prezintă proteine cu o singură bandă pe membrană. Mărimea aproximativă este calculată prin compararea benzilor colorate cu markerii de greutate moleculară adăugați prin electroforeză. Procesul va fi repetat cu proteine structurale precum actina sau tubulina care nu se schimbă între experimente. Cantitatea de proteină țintă depinde de cantitatea de proteină structurală de control între grupuri. Această tehnică asigură o corecție a cantității de proteine totale de pe membrană în cazul unei erori sau al unui transfer incomplet.
Metoda de detecție colorimetrică se bazează pe incubarea unui Western blot cu un substrat care reacționează cu o enzimă reporter (cum ar fi peroxidaza de hrean ) , „șezând” pe un anticorp secundar . Colorantul solubil se transformă într-o formă insolubilă de altă culoare, precipitând lângă enzimă și colorând membrana. Creșterea petelor este limitată prin spălarea colorantului solubil. Nivelul de proteine este evaluat densitometric prin intensitatea colorării sau spectrofotometric .
Metoda de detecție chemiluminiscentă se bazează pe incubarea unei membrane de nitroceluloză cu un substrat care luminesce după interacțiunea cu un reporter secundar de anticorpi. Lumina este înregistrată de un film fotografic sau de o cameră CCD , care surprinde digital un Western blot. Imaginea este analizată densitometric , estimând cantitatea relativă de proteină colorată și dând un rezultat cantitativ în unități de densitate optică. Noul software permite analiza suplimentară a datelor, cum ar fi determinarea greutății moleculare, dacă a fost utilizat un standard adecvat.
Etichetele radioactive nu necesită substraturi enzimatice, dar permit plasarea filmului radiografic medical în fața unui Western blot, permițându-i acestuia (filmului) să interacționeze cu etichetele și să creeze zone întunecate care corespund benzilor proteinei studiate (în imaginea din dreapta). Cererea de metode de detectare radioactivă este în scădere datorită costului ridicat, riscurilor ridicate pentru sănătate și siguranță și alternativele oferite de ECL.
Etichetele fluorescente sunt excitate de lumină și emit lumină cu lungime de undă mai mare, care este detectată de fotosenzori, cum ar fi o cameră CCD echipată cu filtre de emisie adecvate. Aparatul foto realizează o fotografie digitală a western blot, permițând o analiză ulterioară a datelor achiziționate, cum ar fi analiza greutății moleculare și analiza cantitativă western blot.