Nanoscopie prin fluorescență
Nanoscopia prin fluorescență este o metodă de detectare a obiectelor fluorescente folosind un microscop optic , care are o rezoluție spațială de câteva ori mai mare decât limita teoretică a difracției optice (~200 nm).
Descriere
În ultimii ani, în domeniul microscopiei cu fluorescență au fost dezvoltate mai multe abordări noi, care au făcut posibilă depășirea barierei de difracție a rezoluției optice și obținerea unei rezoluții fără precedent de ~10 nm. Aceste metode au început să fie unite sub termenul general de nanoscopie cu fluorescență.
Sistemele de nanoscopie fluorescentă se bazează pe trei abordări fundamental diferite:
- îmbunătățirea focalizării datorită creării de noi scheme optice și utilizării lentilelor cu deschidere unghiulară mare (microscopie 4Pi-, I5M- și I5S-);
- utilizarea fenomenului de reflexie internă totală (microscopie de fluorescență cu reflexie internă totală, TIRFM);
- „pornit” și „oprit” controlat al moleculelor fluorescente și detectarea lor secvențială ( STED , GSD, SPEM (SSIM ) , RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).
Se pot prevedea mai multe aplicații ale tehnicilor nanoscopice fluorescente în biologie și medicină. Nanoscopia vă permite să studiați direct interacțiunile dintre proteine , ADN și ARN și, prin urmare, poate juca un rol semnificativ în dezvoltarea genomicii și proteomicii , în studiul fiziologiei celulare, în înțelegerea mecanismelor fiziopatologice asociate cu formarea afectată a complexului. complexe proteice etc. [1 ]
Aceste abordări sunt discutate mai detaliat mai jos:
- 4Pi și I5M sunt implementate pe baza unui sistem cu două obiective, care îmbunătățește rezoluția de-a lungul axei optice până la 80 nm datorită însumării a două fronturi de lumină sferică opuse la punctul focal. I5S are o rezoluție îmbunătățită în planul focal (până la 100 nm).
- TIRFM face posibilă detectarea obiectelor fluorescente într-un strat limită gros de ~100 nm, cu o rezoluție de până la 10 nm.
- STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, VOPSEA. Absorbția unui cuantum de lumină de către o moleculă este însoțită de tranziția unui electron de la nivelul energiei solului (S 0 ) la un nivel fluorescent excitat (singlet S 1 sau triplet T 1 ). Absorbția poate induce, de asemenea, rearanjamente intramoleculare reversibile (de exemplu, izomerizarea cis-trans ), care au ca rezultat o modificare a spectrului de fluorescență . Oricare dintre tranzițiile S 0 → S 1 , S 0 → T 1 poate fi utilizată pentru a activa/dezactiva fluoroforii și pentru a crește rezoluția.
Astfel, microscopia cu epuizare a emisiilor stimulate (STED) se bazează pe utilizarea simultană a două fascicule de lumină - un fascicul focalizat care excită un fluorofor în zona centrală (S 0 → S 1 ), și un fascicul care are forma bagel și se stinge. fluorofori din jurul zonei centrale (S 1 → S 0 ). Astfel, fluorescența se înregistrează doar din gaura gogoșii. Rezoluţia metodei este determinată de legea unde I s este puterea de radiaţie necesară pentru asigurarea tranziţiei preferenţiale S 1 → S 0 ; I max este puterea de radiație de stingere. Astfel, rezoluția se dovedește a fi reglabilă (în funcție de puterea sursei) și teoretic infinită (la I max /I s → ∞). În practică, a fost atins un prag de ~10 nm, care corespunde dimensiunii macromoleculelor biologice .
Microscopia cu iluminare structurată saturată (SSIM) sau microscopia cu excitație cu model saturat (SPEM) este construită pe un principiu similar . Microscopia de epuizare a stării fundamentale (GSD) implementează un principiu similar, dar stinge starea excitată prin tranziția moleculei la o stare T1 cu viață mai lungă . În cele din urmă, microscopia de tranziție optică fluorescentă saturabilă reversibilă (RESOLFT ), microscopia de localizare cu fotoactivare (PALM) și microscopia de reconstrucție optică stocastică (STORM ) se bazează pe pornirea/dezactivarea fluoroforilor datorită izomerizării lor fotochimice .
Analiza locației fluoroforilor în spațiul 3D este efectuată prin aceste metode în moduri diferite. STED, GSD, SPEM/SSIM și RESOLFT folosesc focalizarea optică pentru a înregistra secvențial un semnal din coordonatele spațiale date; PALM și STORM sting fluoroforii în mod aleatoriu și acumulează simultan semnale de la fluoroforele pornite situate la o distanță de .
Note
- ↑ Peters R. From fluorescence nanoscopy to nanoscopic medicine // Nanomedicine. V. 3, 2008. P. 1–4.
Literatură
- Hell SW Nanoscopie optică în câmp îndepărtat // Știință. 2007. V. 316. P. 1153–1158.