Dot blotting

Dot blot  este o tehnică folosită în biologia moleculară pentru a detecta diverse macromolecule, cum ar fi acizii nucleici sau proteinele. Această tehnică este o simplă simplificare a Western blot : probele care conțin macromoleculele studiate sunt aplicate imediat pe o membrană de nitroceluloză sau PVDF, ocolind etapa de electroforeză preliminară în PAAG (în special, atunci când se lucrează cu proteine).

Protocol de lucru cu membrană PVDF

  1. Aplicați probele de testat pe membrana uscată de PVDF (1-3 µl de soluție per punct). Când lucrați cu o membrană PVDF, tamponul în care sunt dizolvate probele trebuie să aibă o putere ionică suficient de mare , altfel soluția pur și simplu nu poate pătrunde în membrană datorită proprietăților sale hidrofobe.
  2. Membrana trebuie uscată. De obicei, 30 de minute la temperatura camerei sunt suficiente.
  3. Plasați membrana în tampon pentru a reduce legăturile nespecifice ale anticorpilor. Rolul unui agent care reduce interacțiunile nespecifice este de obicei îndeplinit de albumina serică bovină (BSA) sau laptele praf . 20 de minute - 1 oră la temperatura camerei.
  4. Se plasează membrana în tampon primar cu anticorpi. BSA sau lapte praf este, de asemenea, prezent în acest tampon, dar într-o cantitate mai mică. 1 oră - ON, T = 4 С°.
  5. Se spală membrana 3 x 5 min.
  6. Se plasează membrana într-un tampon care conține un anticorp secundar care conține un agent de detectare, cum ar fi peroxidaza de hrean . 1-2 ore la temperatura camerei.
  7. Se spală membrana din nou timp de 3 x 5 min.
  8. Așezați membrana în soluția de detectare. Este mai bine să adăugați 30% peroxid de hidrogen într-o soluție comercială (aproximativ 10-50 µl la 10 ml de soluție). 1-3 minute la temperatura camerei.
  9. Detectare. În cazul utilizării anticorpilor secundari cu peroxidază de hrean se observă radiații chemiluminiscente cauzate de tăierea substratului din soluția de detecție cu peroxidază de hrean. În cazul utilizării unui dispozitiv care înregistrează chemiluminiscența, este suficientă o expunere foarte mică (până la 2 minute).

Vezi și