O unitate formatoare de colonii (abreviar CFU ) este o unitate care evaluează numărul de celule microbiene ( bacterii , ciuperci , viruși , etc.) dintr-o probă care sunt viabile și capabile să se înmulțească prin diviziune în condiții controlate. Numărarea unităților formatoare de colonii necesită cultivarea microorganismelor și numărarea numai a celulelor viabile, spre deosebire de examinarea microscopică, care numără toate celulele, vii sau moarte. Numărarea vizuală a coloniilor dintr-o cultură celulară după însămânțare este posibilă numai după formarea de colonii mari, iar la numărarea acestora, este posibil să nu fie clar dacă provine dintr-o singură celulă sau dintr-un grup de celule. Exprimarea rezultatelor ca unități formatoare de colonii poate elimina această incertitudine.
Scopul numărării pe plăci este de a estima numărul de celule prezente pe baza capacității lor de a forma colonii în anumite condiții de mediu, temperatură și timp. Teoretic, o celulă viabilă poate da naștere la o colonie prin replicare. Cu toate acestea, celulele singulare sunt o excepție și cel mai adesea progenitorul unei colonii este un grup de celule care există împreună. În plus, multe bacterii cresc în lanțuri (de exemplu, Streptococcus ) sau grupuri (de exemplu, Staphylococcus ). Din aceste motive, estimarea numărului de microbi care utilizează CFU în majoritatea cazurilor este mai mică decât numărul real de celule vii individuale prezente în probă. Numărul de CFU presupune că fiecare colonie este separată și se bazează pe o singură celulă microbiană viabilă [1] .
De exemplu, numărul de CFU pentru E. coli prin metoda plăcii este liniar în intervalul de la 30 la 300 de unități pe o placă Petri de dimensiune standard [2] . Astfel, pentru a se asigura că o probă va produce CFU în acest interval, sunt necesare diluții în serie a mai multor culturi. De regulă, se folosesc diluții de zece ori și o serie de diluții sunt semănate în două sau trei repetări în intervalul selectat de diluții. Adesea se inoculează 100 µl din amestec, dar se folosesc și cantități mai mari (până la 1 ml ) . Volumele mai mari de acoperire măresc timpul de uscare, dar adesea nu duc la o precizie mai mare, deoarece pot fi necesare etape suplimentare de diluare [3] . Apoi, coloniile sunt numărate într-un interval liniar, iar apoi rapoartele CFU / g (sau CFU / ml) din amestecul inițial sunt derivate matematic, ținând cont de cantitatea aplicată și de factorul său de diluție.
Un amestec cu o concentrație cunoscută necunoscută de microorganisme este adesea diluat în serie pentru a obține cel puțin o placă cu un număr numărabil de colonii. Avantajul acestei metode este că diferite tipuri de microorganisme pot produce colonii care sunt clar diferite între ele atât microscopic, cât și macroscopic. Morfologia coloniilor poate fi de mare ajutor în identificarea microorganismelor prezente.
O examinare preliminară a morfologiei coloniei a microorganismului poate oferi o mai bună înțelegere a modului în care CFU/mL observat este legat de numărul de celule viabile pe mililitru. Alternativ, în unele cazuri, numărul mediu de celule per CFU poate fi redus prin agitarea probei înainte de diluare. Cu toate acestea, multe microorganisme sunt prea sensibile la agitare și proporția de celule viabile poate scădea atunci când sunt plasate într-o cutie Petri.
Concentrațiile unităților formatoare de colonii pot fi exprimate atât în termeni absoluti, cât și în termeni logaritmici, unde valoarea este logaritmul de bază 10 al concentrației .
Numărarea coloniilor se face în mod tradițional manual cu un stilou și un numărător de clicuri. Aceasta este de obicei o sarcină simplă, dar poate deveni foarte intensivă în muncă și consumatoare de timp dacă sunt multe probe de calculat. Alternativ, pot fi utilizate soluții semi-automate (software) și automate (hardware și software).
Coloniile pot fi numerotate din fotografiile plăcilor de probă folosind instrumente software. Pentru a face acest lucru, fiecare vas Petri este de obicei fotografiată și apoi sunt analizate toate imaginile. Acest lucru se poate face cu o simplă cameră digitală sau chiar cu o cameră web. Deoarece de obicei durează mai puțin de 10 secunde pentru a obține o singură imagine, spre deosebire de câteva minute pentru numărarea manuală CFU, această abordare economisește de obicei mult timp. De asemenea, este mai obiectiv și vă permite să extrageți alte variabile, cum ar fi dimensiunea și culoarea coloniei.
Pe lângă software-ul pentru PC , sunt disponibile aplicații pentru dispozitivele Android și iOS pentru numărarea semi-automată și automată a coloniilor. Camera încorporată este folosită pentru a fotografia placa de agar, iar un algoritm intern sau extern procesează datele imaginii și estimează numărul de colonii [9] [10] [11] .
Sistemele automate sunt folosite pentru a contracara erorile umane, deoarece multe dintre metodele de numărare a celulelor umane au o probabilitate mare de eroare. Deoarece cercetătorii numără manual celulele utilizând lumina transmisă, această metodă predispusă la erori poate avea un impact semnificativ asupra concentrației calculate în mediul lichid inițial, mai ales atunci când celulele sunt inițial într-o concentrație scăzută în amestec.
Sistemele complet automatizate sunt, de asemenea, disponibile de la unii producători de biotehnologie [12] . Ele tind să fie scumpe și să nu fie la fel de flexibile ca software-ul de sine stătător, deoarece hardware-ul și software-ul sunt concepute pentru a funcționa împreună într-o anumită configurație.
Unele sisteme automate, cum ar fi sistemele MATLAB, permit numărarea celulelor fără a fi nevoie de colorare. Acest lucru permite reutilizarea coloniilor pentru alte experimente fără riscul de a distruge coloniile de microorganisme. Cu toate acestea, dezavantajul acestor sisteme automatizate este că este extrem de dificil să distingem coloniile de acumulările de praf sau zgârieturile de pe plăcile de agar cu sânge, deoarece atât praful, cât și zgârieturile pot crea o mare varietate de combinații de forme și aspect [13] .
În loc de unități care formează colonii, puteți utiliza parametrii „Numărul cel mai probabil” (ing. Numărul cel mai probabil, MPN), precum și unități Fishman modificate (MFU). Cea mai probabilă metodă de numărare numără celulele viabile, ceea ce este util atunci când se numără concentrațiile scăzute de celule sau se numără microorganismele conținute în produsele în care particulele străine fac imposibilă numărarea pe cutiile Petri. Unitățile Fishman modificate iau în considerare și microorganismele care sunt viabile, dar nu sunt cultivate din niciun motiv.