Mouse-ul knockout

Un șoarece knockout  este un șoarece de laborator modificat genetic în care una dintre gene este eliminată intenționat prin ștergere sau înlocuire cu o anumită secvență de nucleotide . Cu ajutorul lor, este ușor de studiat rolurile genelor secvențiate ale căror funcții nu au fost încă determinate. Prin perturbarea unei anumite gene și examinarea diferențelor rezultate față de comportamentul sau fiziologia normală, experimentatorii pot încerca să determine funcția acesteia.

Fiziologia umană este similară cu cea a șoarecilor, iar oamenii de știință pot folosi aceste animale pentru a testa tehnologii medicale legate de fiziologia umană, deoarece utilizarea embrionilor umani nu este acceptată de comunitatea științifică din motive etice. Prin urmare, șoarecii sunt în prezent cea mai potrivită specie de animale de laborator pentru care metoda knockout poate fi aplicată cu ușurință. Primul șoarece knockout a fost creat de Mario R. Capecchi , Martin Evans și Oliver Smithies în 1989, pentru care au fost distinși cu Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în 2007. Aspecte ale tehnologiei mouse-ului knockout și șoarecii înșiși au fost brevetate în multe țări de companii private. Knockout-ul genelor la șobolanii de laborator este mult mai dificil și a devenit posibil abia din 2003 [1] [2] .

Utilizare

Oprirea activității unei gene oferă indicii valoroase despre modul în care funcționează. Din cauza asemănării dintre genele umane și cele ale șoarecilor, observarea caracteristicilor șoarecilor knockout oferă date pentru cercetători. Folosind informațiile, oamenii de știință trag concluzii despre rolul unei gene în dezvoltarea unui organism [3] , în special, despre capacitatea de a răspunde la boli la oameni.

Exemple de cercetări în care șoarecii knockout au fost utili includ studiul și modelarea diferitelor tipuri de cancer, obezitate, boli de inimă, diabet, artrită, abuz de substanțe, anxietate, îmbătrânire și boala Parkinson . Șoarecii knockout oferă, de asemenea, un context biologic în care medicamentele și alte terapii pot fi dezvoltate și testate.

Procedura

„Pentru a obține șoareci knockout, constructul rezultat din inginerie genetică este introdus în celulele stem embrionare, unde constructul suferă recombinare somatică și înlocuiește gena normală, iar celulele modificate sunt implantate în reproducerea de noi soiuri prin selecție clasică este aproape imposibil, prin urmare. , în prezent, principalele speranțe sunt puse pe ingineria genetică. Knockout-ul genei poate fi folosit pentru a studia funcția unei anumite gene. Acesta este numele dat tehnicii de ștergere a uneia sau mai multor gene, care permite studierea consecințelor unei astfel de mutații. Pentru knockout se sintetizează aceeași genă sau blastocist al mamei sale surogat” [4] .

Schema de reproducere pentru a obține șoareci knockout. Crearea șoarecilor începe în momentul creării culturilor celulare, introducându-se organismul dorit într-un embrion tânăr. Folosind fagul lambda sau cosmidul, gena țintă este extrasă din biblioteca genomică de șoarece prin metoda in vivo. În schimb, este inserat un marker selectabil dominant, în timp ce gena țintă este ștearsă în același timp . „Ca urmare, se obține o plasmidă hibridă (biologie moleculară) , în care segmente ale genei de șoarece țintă (secvențe de flancare) sunt atașate la markerul selectabil din dreapta și din stânga. Celulele cu o genă inactivată sunt inserate în blastocite. Celulele stem embrionare sunt izolate din blastocistul de șoarece (embrion foarte tânăr) și cultivate in vitro. Pentru acest exemplu, vom lua celule stem albe de șoarece. Blastocisturile care conțin celule atât sălbatice, cât și celule knockout sunt injectate în uterul mamei adoptive. Acest lucru are ca rezultat descendenți sau de tip sălbatic, colorați în aceeași culoare ca un donor de blastocist (gri) sau o himeră (mixt) și parțial eliminati. Șoarecii Chimera sunt încrucișați cu un șoarece normal de tip sălbatic (gri), producând descendenți fie albi și heterozigoți pentru gena knocked-out, fie gri și de tip sălbatic.Șoarecii heterozigoți albi pot fi crescuți ulterior pentru a produce șoareci homozigoți pentru gena knockout.

Există mai multe variații în procedura de obținere a șoarecilor knockout; mai jos este un exemplu tipic.

Noua secvență din etapa 1 este introdusă în celulele stem din etapa 2 prin electroporare. Ca rezultat al procesului natural de recombinare omoloagă, unele dintre celulele stem electroporate vor încorpora noua secvență a genei knockout în cromozomii lor în locul genei originale. Șansele unui eveniment de recombinare reușit sunt relativ scăzute, astfel încât majoritatea celulelor modificate vor avea noua secvență doar pe unul dintre cei doi cromozomi corespunzători - sunt considerate heterozigote. Celulele care au fost transformate cu un vector care conține o genă de rezistență la neomicină și o genă herpes tk+ sunt crescute într-o soluție care conține neomicină și ganciclovir pentru a selecta transformările care au avut loc prin recombinare omoloagă. Orice inserție de ADN care are loc ca urmare a unei inserții accidentale va muri deoarece testează pozitiv atât pentru gena de rezistență la neomicine, cât și pentru produsul genei herpes tk+, al cărui produs genic reacţionează cu ganciclovir pentru a forma o toxină mortală. Mai mult, celulele care nu integrează niciunul dintre materialele genetice testează negativ pentru ambele gene și, prin urmare, mor ca urmare a otrăvirii cu neomicina.

Celulele stem embrionare care au inclus gena knockout sunt izolate din celulele nealterate folosind gena marker din etapa 1. De exemplu, celulele nealterate pot fi distruse cu un agent toxic la care celulele modificate sunt rezistente. Celulele stem embrionare knockout din etapa 4 sunt injectate într-un blastocist de șoarece. Pentru acest exemplu, folosim blastociste de șoarece gri. Blastocistele conțin acum două tipuri de celule stem: originale (de la un șoarece gri) și celule knockout (de la un șoarece alb). Aceste blastociste sunt apoi implantate în uterul șoarecilor femele, unde se dezvoltă. Astfel, șoarecii nou-născuți vor fi himere: unele părți ale corpului lor sunt formate din celulele stem originale, altele din celule stem eliminate. Blana lor va prezenta pete albe și gri, cu pete albe derivate din celule stem eliminate și pete gri de la blastocistul primitor. Unii șoareci himere nou-născuți vor avea gonade derivate din celule stem eliminate și, prin urmare, vor produce ouă sau spermatozoizi care conțin gena eliminată. Când acești șoareci himere sunt încrucișați cu alți șoareci de tip sălbatic, unii dintre descendenții lor vor avea o copie a genei knockout în toate celulele lor. Acești șoareci nu rețin niciun ADN de șoarece gri și nu sunt himere, totuși sunt încă heterozigoți. Când acești descendenți heterozigoți se încrucișează, unii dintre descendenții lor vor moșteni gena knockout de la ambii părinți; nu poartă o copie funcțională a genei originale nemodificate (adică sunt homozigoți pentru acea alela). O explicație detaliată a modului în care sunt creați șoarecii knockout (KO) se află pe site-ul web al Premiului Nobel pentru Fiziologie sau Medicină din 2007 [5] .

Restricții

National Institutes of Health discută câteva limitări importante ale acestei tehnici [6] .

La fel ca toți șoarecii de laborator, șoarecii knockout nu au o imunitate bună la bolile naturale. Dar acest lucru este compensat de sensibilitatea lor ridicată la agentul patogen specific pentru care sunt creați.

În timp ce tehnologia mouse-ului knockout este un instrument valoros de cercetare, există câteva limitări importante. Aproximativ 15 la sută din knockout-urile genelor sunt letale din punct de vedere al dezvoltării, ceea ce înseamnă că embrionii modificați genetic nu pot crește în șoareci adulți. Această problemă este adesea depășită cu mutații condiționate. Lipsa șoarecilor adulți limitează cercetarea la dezvoltarea embrionară și deseori face dificilă determinarea funcției genei în relație cu sănătatea umană. În unele cazuri, o genă poate îndeplini o funcție diferită la adulți decât o face în embrioni în curs de dezvoltare.

Eliminarea unei gene poate, de asemenea, să nu aibă ca rezultat schimbări vizibile la șoarece sau chiar poate duce la caracteristici diferite de cele observate la oamenii care au aceeași genă inactivată. De exemplu, mutațiile din gena p53 sunt asociate cu mai mult de jumătate din cancerele umane și adesea conduc la tumori într-un anumit set de țesuturi. Cu toate acestea, atunci când gena p53 este eliminată la șoareci, animalele dezvoltă tumori într-o matrice de țesut diferită.

Există variabilitate pe parcursul procedurii, în mare măsură în funcție de tulpina de la care au fost obținute celulele stem. În mod obișnuit, sunt utilizate celule derivate din tulpina 129. Această tulpină specifică nu este potrivită pentru multe experimente (de exemplu comportamentale), deci este foarte comună încrucișarea descendenței cu alte tulpini. Unii loci genomici s-au dovedit a fi foarte greu de identificat. Motivele pot fi prezența secvențelor repetitive, metilarea extensivă a ADN-ului sau heterocromatina. Prezența confuză a 129 de gene învecinate într-un segment knockout al materialului genetic a fost denumită „efectul genei de flancare”. [7] Au fost propuse metode și linii directoare pentru a rezolva această problemă [7] .

O altă limitare este aceea că șoarecii knockout normali (adică necondiționați) se dezvoltă în absența genei studiate. Uneori, pierderea activității în timpul dezvoltării poate masca rolul unei gene la vârsta adultă, mai ales dacă gena este implicată în procese multiple care acoperă dezvoltarea. Apoi, sunt necesare abordări de mutații condiționate/inductibile care să permită mai întâi șoarecelui să se dezvolte și să se maturizeze în mod normal până când gena de interes este îndepărtată.

O altă limitare majoră este lipsa de adaptări evolutive în modelul knockout care poate apărea la animalele de tip sălbatic după mutația lor naturală. De exemplu, coexpresia specifică eritrocitelor a GLUT1 cu stomatina este un mecanism compensator la mamiferele care nu sunt capabile să sintetizeze vitamina C [8] .

Note

  1. ↑ Helen R. Pilcher. Este un knockout   // Natura . - 2003. - doi : 10.1038/news030512-17 .
  2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN. Producția de șobolani knockout folosind mutageneza ENU și un test de screening pe bază de drojdie  //  Nature Biotechnology. - 2003. - Vol. 21 , iss. 6 . — P. 645–51 . - doi : 10.1038/nbt830 . — PMID 12754522 .
  3. ↑ Shchelkunov S. N. Inginerie genetică . - Editura Universității din Siberia, 2004. - P. 453.
  4. ↑ Rizvanova A. Kh. Principii bioetice și inginerie genetică . - 2013. - S. 2.
  5. ↑ 2007 Premiul Nobel pentru  Medicină . nobelprize.org . Preluat la 21 ianuarie 2022. Arhivat din original la 25 iunie 2018.
  6. ↑ Fișă informativă Knockout Mice Arhivată 16 decembrie 2018 la Wayback Machine / National Human Genome Research Institute
  7. ↑ 1 2 Robert Gerlai. Studii de țintire genetică a comportamentului mamiferelor: este mutația sau genotipul de fundal?  (engleză)  // Tendințe în neuroștiințe. - 1996. - Mai (vol. 19). - P. 177-181 . — ISSN 0166-2236 . - doi : 10.1016/S0166-2236(96)20020-7 .
  8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D., Holmes A., Wolfer D. Standarde pentru publicarea studiilor mutante la șoarece  //  Genes, Brain and Behavior. - 2009. - 28 ianuarie (vol. 8). - P. 1-4 . — ISSN 1601-1848 . - doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x .
  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii