Transfecția

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 21 februarie 2020; verificările necesită 2 modificări .

Transfecția  este procesul de introducere a unui acid nucleic în celulele eucariote printr-o metodă non-virală [1] . Un proces similar în raport cu procariotele se numește transformare .

Transfecția implică de obicei formarea unor deschideri în membrana plasmatică prin care materialul extracelular poate pătrunde în celulă. Materialul genetic cum ar fi ADN-ul sau ARN -ul poate fi transfectat , precum și proteinele , cum ar fi anticorpii . Pentru transfecție, se utilizează adesea un câmp electric puternic ( electroporație ) sau lipide încărcate electrostatic , capabile să formeze lipozomi , structuri care fuzionează cu membrana plasmatică, expulzând materialul închis în ele în celulă. Sunt cunoscute și alte metode de transfecție.

Sensul original al cuvântului transfecție : infecție pentru transformare, adică introducerea unui genom viral în celule , în urma căreia începe infecția. Dar, întrucât termenul de transformare are un înțeles diferit în aplicarea la oameni și animale (modificări genetice care permit celulelor să fie păstrate în cultură pentru o lungă perioadă de timp, depășind limita Hayflick , care este tipică, de exemplu, pentru celulele canceroase), s-a propus ca termenul de transfecție să fie utilizat ca înlocuitor pentru termenul de transformare în sensul modificării fenotipului prin introducerea unui acid nucleic străin.

Metode de transfecție

Materialele utilizate pentru transfecție sunt de trei tipuri principale: microparticule, polimeri cationici și lipozomi.

Una dintre cele mai ieftine și mai puțin fiabile metode este transfecția cu fosfat de calciu, inventată în anii 1970 [2] [3] ). O soluție izotonă care conține tampon HEPES , fosfat și ADN este amestecată cu clorură de calciu. Un precipitat este format din particule de fosfat de calciu și ADN, a căror dimensiune se află în intervalul de nanometri. Suspensia este adăugată în cultura celulară, care absorb particulele (cum anume, autorii nu au precizat). Această transfecție funcționează cel mai bine cu celulele renale embrionare umane linia 293 (HEK 293), dar multe alte linii sunt transfectate cu ceva mai puțină eficiență.

O metodă mai eficientă folosește lipozomi, structuri cu dimensiuni mult mai mici decât celulele, constând dintr-o membrană lipidică care înconjoară ADN-ul într-o fază apoasă. Structura lor seamănă cu structura celulelor, care sunt, de asemenea, înconjurate de o membrană fosfolipidă. Lipozomii pot fuziona cu membrana celulară, după care spațiul lor intern fuzionează cu conținutul celulelor. Pentru formarea lipozomilor, se folosesc de obicei lipide încărcate pozitiv, deoarece ADN-ul și fosfolipidele celulare sunt încărcate negativ, iar particulele cu sarcini electrostatice diferite sunt atrase unele de altele.

O altă metodă de transfecție este utilizarea polimerilor solubili în apă încărcați pozitiv, cum ar fi DEAE-dextran sau polietilenimină. ADN-ul încărcat negativ leagă policationii, iar complexul rezultat este preluat de celule prin endocitoză .

ADN-ul poate fi, de asemenea, introdus în celule prin microinjecție sau prin utilizarea unui „ pistol genic ”. Acesta din urmă utilizează microparticule dintr-un solid inert (de obicei aur) cu care este fuzionat ADN-ul.

Impalefecția este o metodă de livrare a genelor care utilizează nanomateriale , cum ar fi nanofibre de carbon , nanotuburi de carbon , nanofire . Nanostructurile asemănătoare acului sunt sintetizate perpendicular pe suprafața substratului. ADN-ul plasmidic care conține gena și este destinat eliberării intracelulare este atașat de suprafața nanostructurii. Cipul cu matrice de astfel de ace este apoi presat pe celule sau țesuturi. Celulele expuse la nanostructuri pot exprima gena (genele) eliberată.

Alte metode de transfecție includ electroporarea , nucleofecția, șocul termic, utilizarea particulelor magnetice și o varietate de reactivi comerciali distribuiți de producătorii de produse de cercetare.

În plus, ADN-ul poate fi livrat celulelor de către viruși. În acest caz, procesul se numește transducție , iar celulele sunt transduse.

Transfecția este stabilă și tranzitorie

Adesea, pentru a rezolva problema, este suficient să introduceți ADN-ul în celule doar pentru o perioadă de timp, suficient pentru exprimarea acestuia . Deoarece ADN-ul transfectat nu este în mod normal încorporat în genomul nuclear și nu se reproduce, ADN-ul străin se pierde rapid pe măsură ce celulele proliferează. O astfel de transfecție se numește tranzitorie .

Dacă este necesară fixarea genei introduse în descendența celulelor transfectate, atunci aceasta ar trebui inclusă în genomul nuclear. O astfel de transfecție se numește stabilă . Pentru a face acest lucru, o altă genă este introdusă în celule, care facilitează selecția celulelor transfectate și, prin urmare, este numită un marker de selecție . De exemplu, un marker de selecție ar putea fi o genă de rezistență la un antibiotic . Unele celule includ complet accidental ADN străin în genomul lor, iar sarcina în acest caz este doar de a selecta descendența unor astfel de celule (clona), ceea ce este ușor de făcut în prezența unui antibiotic care este dăunător pentru toate celulele, cu excepția celor transfectate. .

Geneticina, cunoscută și ca G418, puromicina, doximicină etc., sunt adesea folosite ca antibiotice pentru selectarea celulelor transfectate.

Integrarea ADN-ului străin în genomul celular are loc datorită prezenței unui mecanism de reparare în celulă . Prin urmare, eficiența inserției este crescută dacă ADN-ul introdus în celule este mai degrabă liniar decât circular, așa cum sunt de obicei plasmidele bacteriene . Desigur, prezența enzimelor de restricție în celule asigură într-o oarecare măsură liniarizarea aleatorie a plasmidelor circulare, dar poate apărea și în funcție de gena de selecție sau gena care ar trebui integrată în genom. Prin urmare, constructele modificate genetic sunt de obicei pre-linearizate atunci când se pregătesc transfecția stabilă.

Și mai multe lucrări pregătitoare necesită inserarea unei gene într-un loc specific din genom, ceea ce este necesar, de exemplu, pentru knockout genetic . În acest caz, într-un construct modificat genetic, caseta de gene introduse în cromozom ar trebui să fie situată între două secțiuni complementare ADN-ului cromozomial, lungi de 1000-3000 de perechi de baze (așa-numitele umeri ).

Note

  1. ↑ Transfectare (link descendent) . Data accesului: 26 septembrie 2008. Arhivat din original la 17 decembrie 2008. 
  2. ↑ Graham FL, van der Eb AJ O nouă tehnică pentru testarea infecțiozității adenovirusului uman 5 ADN  //  Virologie: jurnal. - 1973. - Vol. 52 , nr. 2 . - P. 456-467 . - doi : 10.1016/0042-6822(73)90341-3 . — PMID 4705382 .
  3. ^ Bacchetti S., Graham F. Transfer of the gene for thymidin kinase to thymidin kinase-deficient human cells by depleted herpes simplex viral DNA  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal  . - 1977. - Vol. 74 , nr. 4 . - P. 1590-1594 . - doi : 10.1073/pnas.74.4.1590 . — PMID 193108 .

Literatură

Link -uri

  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii