Electroporație

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită la 27 ianuarie 2022; verificările necesită 2 modificări .

Electroporația  este crearea de pori într-o membrană lipidică cu două straturi sub influența unui câmp electric. Acest fenomen este folosit în biotehnologie pentru a introduce macromolecule (de obicei ADN sau ARN ) în celulele de mamifere , bacteriene sau vegetale și este, de asemenea, utilizat în medicină și industrie.

Întărirea câmpului electric în timpul electroporării

Fenomenul de electroporare se bazează pe faptul că membranele au capacitatea de a concentra un câmp electric. Să se aplice o diferență de potențial U între doi electrozi paraleli plati aflați la o distanță L, iar golul dintre ei este umplut cu un electrolit slab conductiv. Apoi intensitatea câmpului este distribuită uniform pe întreg spațiul dintre ele. Acum să plasăm o membrană lipidică cu două straturi în centrul celulei, care are o rezistență atât de mare încât poate fi considerată ca un dielectric neconductor. Apoi întreaga diferență de potențial U va fi concentrată pe membrană.

Câștigul câmpului electric va fi evident egal cu L/h ~ 10^6 dacă alegem L ~ 1 cm, h ~ 5 nm. Astfel, în acord cu rezultatele experimentale, este suficient să se aplice electrozilor o diferență de potențial de ordinul a sute de milivolți pentru a induce electroporarea stratului dublu. Dacă între electrozi se află acum celule cu un diametru de aproximativ 10 microni și dorim să facem electroporarea lor, vor trebui aplicate tensiuni mult mai mari. Într-adevăr, datorită rezistenței mari a membranei, soluția din celulă va fi echipotențială, adică câmpul exterior va fi ecranat de ioni mobili, care formează plăci difuze din straturi electrice duble. Astfel, saltul de tensiune pe celulă va fi de 2UR/L, care va fi concentrat pe membrană în regiunea celor doi poli ai celulei. Dacă acceptăm că este necesar să avem, să zicem, 0,5 V, atunci va fi necesar să aplicăm electrozilor U ~ L / R * 0,5 V. Astfel, având L ~ 1 cm, R ~ 5∙10^-4 cm, obținem U ~ (1∙0,5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 kV. Prin urmare, în experimentele cu suspensii celulare și lipozomi, este necesar să se utilizeze electroporatoare speciale capabile să genereze impulsuri scurte cu o amplitudine de până la 1-10 kV.

Când impulsurile de câmp electric cu o putere de la câteva sute la câteva mii de volți pe cm și o durată de la zeci de microsecunde la zeci de milisecunde sunt aplicate unei suspensii celulare, este posibil să se provoace o creștere bruscă a conductibilității membranelor celulare. După un tratament electric moderat, conductivitatea celulei scade la valori normale în câteva secunde până la câteva minute. Tratamentul electric mai intens duce la distrugerea ireversibilă a unor celule.

În experimentele cu celule, este dificil de controlat tensiunea aplicată direct membranei celulare. În plus, membrana celulară este un sistem extrem de complex. Principalele funcții de barieră ale membranei sunt îndeplinite de un strat dublu fosfolipidic, care este pătruns cu proteine ​​care acționează ca canale selective sau pompe active pentru ioni și metaboliți. Motivele posibile pentru creșterea conductivității electrice ar putea fi modificări atât în ​​stratul dublu lipidic, cât și în proteine. Experimentele cu o membrană lipidică artificială cu două straturi (BLM) au arătat posibilitatea defectării sale electrice la tensiuni apropiate de cele la care se observă defalcarea în membrana celulară. S-a demonstrat că defalcarea electrică a BLM dintr-o anumită compoziție poate fi reversibilă. Acest lucru indică faptul că defalcarea componentei lipidice este responsabilă pentru creșterea permeabilității celulare. Experimentele cu BLM au arătat că defecțiunea electrică are loc stocastic, iar durata medie de viață a membranei depinde neliniar de tensiune. Aceste observații au condus la dezvoltarea unei teorii a formării și dezvoltării porilor în straturile duble lipide lichide într-un câmp electric. La sfârșitul anilor 1990, folosind măsurători de înaltă precizie ale conductivității membranei, a fost posibil să se înregistreze apariția unor electropori unici în BLM. Diametrul lor mediu este de aproximativ 0,5 nm. În membranele celulare, acestea au fost detectate folosind microscopia electronică.

Teoria electroporării membranei

Teoria electroporației BLM sugerează că are loc o rearanjare locală a structurii în membrana lipidică cu două straturi, ceea ce duce la apariția unui canal de apă. Sunt posibile două configurații de bază ale porilor, hidrofile și hidrofobe. Într-un por hidrofob, pereții porilor sunt căptușiți cu cozi lipidice, în timp ce într-un por hidrofil, sunt căptușiți cu capete fosfolipide. La raze mici, un por hidrofob este favorabil energetic, iar la raze mari, un por hidrofil. Apa are o constantă dielectrică mai mare decât lipidele. Prin urmare, o membrană care conține pori are mai puțină energie într-un câmp electric extern. Acest câștig de energie este proporțional cu aria porului și pătratic în raza acestuia. La o rază a porilor r*, energiile porilor hidrofobi și hidrofili devin egale. Există un minim local pe curba de energie care corespunde stării conductoare metastabile a stratului dublu, din care acesta, cu o anumită frecvență, trece în starea inițială neperturbată cu o conductivitate scăzută a sistemului, sau suferă o întrerupere. Viteza de formare a porilor hidrofili într-un strat dublu lipidic de unitate de suprafață (Kc) poate fi descrisă prin ecuație

Unde

,

Aici, a este aria pe o moleculă de lipide, d este grosimea dublu strat,  este constanta dielectrică a vidului,  este permittivitatea dielectrică a stratului dublu,  este permittivitatea apei, k este constanta Boltzmann,  este frecvența fluctuațiilor laterale ale molecule de lipide,  este raza porilor corespunzătoare stării de tranziție, T este temperatura, U este tensiunea electrică pe stratul dublu,  este energia de activare a porului în absența unui câmp electric.

Se presupune că rata de creștere excesivă a porilor nu depinde de câmpul electric aplicat și de densitatea porilor pe stratul dublu.

Livrarea macromoleculelor către celule prin electroporare

Experimentele descrise mai sus au fost de fapt reduse la măsurarea curentului electric transportat de ionii mici prin pori. Alături de aceasta, s-a constatat că tratamentul electric favorizează transferul prin membrane a macromoleculelor, a căror dimensiune depășește diametrul electroporilor. Mai mult, s-a observat o corelație între electroporare și transportul de molecule mari. În lucrări științifice, pe exemplul transportului moleculelor de ADN, s-a dovedit că acestea sunt capabile să extindă porii, care apoi încet (~ 100 sec.) Se relaxează la starea lor inițială. În plus, experimentele directe de acolo au arătat, de asemenea, că electroforeza ADN -ului joacă un rol important nu numai în stadiul de transfer al acestor molecule către celulă, ci și la trecerea prin membrană. Câmpul electric presează literalmente ADN-ul plasmidei într-un por mic, în timp ce îl extinde. Putem spune că moleculele de ADN plasmidic joacă în sine rolul gloanțelor microscopice de aur care sunt folosite în metoda „pistolului cu gene”. Doar forțele motrice sunt de altă natură - electrice în primul caz, mecanice în al doilea. O altă inovație importantă implementată în lucrările științifice este utilizarea unei tehnici de procesare electrică în 2 impulsuri, care a făcut posibilă separarea în timp a două funcții de câmp - electroporație și electroforetică. Primul impuls a fost puternic, dar scurt; apoi a urmat un interval de durată variabilă și, în final, a fost pornit un câmp constant slab. Introducerea ADN-ului înainte de primul puls a dus la o transfecție ridicată și la transferul de molecule mari de dextran, în timp ce introducerea ADN-ului în intervalul interpuls nu a avut aproape niciun efect.

În ultimul deceniu, electroporația a fost folosită pentru transferul transdermic de medicamente în corpul uman. Electroporația este baza mai multor tehnici de transfer transdermic denumite acvaforeză , mezoterapie neinvazivă , mezoterapie fără ace sau mezoterapie fără injecție.

Aplicații medicale

Metoda de electroporare este utilizată în tratamentul bolilor oncologice: electroporarea ireversibilă a unei tumori duce la distrugerea locală a celulelor sale, impulsurile electrice de microsecunde de 2000-3000 de volți în membranele celulelor tumorale formează micropori, ceea ce duce la perturbarea homeostaziei celulare. și moartea celulelor [1] .

Aplicații industriale

Instalațiile industriale pentru electroporarea produselor (tehnologia se numește PEF - câmp electric impuls) sunt utilizate ca una dintre etapele procesului de producție: în prepararea sucurilor și smoothie-urilor, ca metodă de dezinfecție mai blândă decât pasteurizarea sau ultra -pasteurizarea și in productia de produse congelate si uscate - pentru o mai buna conservare a proprietatilor organoleptice ale produselor, reducerea consumului de apa si a pierderilor de productie. Compania lider mondial în implementarea tehnologiei în producția alimentară este Elea GmbH din Germania [2] .

Note

  1. ↑ Salvarea unui pacient cu adenocarcinom pancreas inoperabil a fost metoda electroporării ireversibile . www.ronc.ru _ Centrul Național de Cercetare de Oncologie denumit după N.N. N. N. Blokhin (21 ianuarie 2022). Preluat: 27 ianuarie 2022.
  2. ↑ Elea GmbH  . www.potatopro.com . Preluat: 18 ianuarie 2022.

Link -uri