Anizotropie de fluorescență

Anizotropia de fluorescență ( polarizarea fluorescenței) este  un fenomen fizic constând în intensități diferite de lumină emisă de un fluorofor de-a lungul diferitelor axe de polarizare . Pionierii cercetării în acest domeniu al științei au fost Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] și Andreas Albrecht [2] . Metodele bazate pe analiza polarizării fluorescenței sunt utilizate pe scară largă în screening a compușilor cu greutate moleculară micăinteracționează cu proteinele și în studiul structurii proteinelor.

Principiul metodei

Fenomenul de fluorescență se bazează pe tranziția unei molecule la o stare excitată la absorbția unui foton . După o scurtă întârziere (timpul caracteristic de fluorescență τ ), molecula revine la starea fundamentală , cedând o parte din energie sub formă de căldură și emițând un alt foton. În timpul acestor evenimente, electronii moleculei sunt redistribuiți. În acest sens, excitarea de către un foton este posibilă numai cu o anumită orientare a vectorului câmpului electric luminos în raport cu moleculă, iar fotonul emis este polarizat într-un anumit mod în raport cu moleculă.

Dacă un grup de fluorofori este iluminat cu lumină polarizată, moleculele care sunt orientate într-un anumit interval de unghiuri în raport cu planul de polarizare vor intra în starea excitată. Dacă sunt staționare, lumina emisă va fi, de asemenea, polarizată la un anumit unghi. Această anizotropie intrinsecă ( r 0 ) este de obicei măsurată prin încorporarea fluoroforilor într - un alcool polihidroxilic congelat .

Gradul de polarizare a luminii emise poate fi redus dacă fluoroforii sunt liberi să se rotească. Gradul de scădere a corelației dintre polarizarea luminii absorbite și emise depinde de raportul dintre timpul caracteristic de modificare a orientării spațiale a fluoroforului ϕ și timpul caracteristic de fluorescență τ . Motivul schimbării orientării fluoroforului poate fi fie rotația întregii molecule, fie rotația doar a fragmentului său care conține fluoroforul. Măsura anizotropiei este legată de viteza de rotație prin următoarea relație:

,

unde r  este anizotropia observată, r0 este anizotropia intrinsecă  a moleculei, τ  este timpul caracteristic de fluorescență și ϕ  este timpul caracteristic de rotație.

Un astfel de raționament este aplicabil numai atunci când fluoroforii sunt suficient de departe unul de celălalt. Dacă sunt în apropiere, pot face schimb de energie datorită rezonanței Förster ( ing.  FRET ), ducând la o scădere a anizotropiei observate sau la o scădere mai puternică a corelației. Această implementare a FRET este denumită emFRET (FRET de migrare a energiei).

Aplicație

Anizotropia de fluorescență poate fi utilizată pentru a determina constantele de legare sau pentru a studia cinetica reacțiilor însoțite de modificări ale timpilor de rotație ai moleculelor. De exemplu, dacă un fluorofor este atașat la o moleculă mică, viteza de rotație a acestuia poate fi redusă semnificativ atunci când se leagă de o proteină. Dacă fluoroforul este atașat la o moleculă mai mare, diferența de polarizare între starea liberă și cea legată va fi mai mică (inclusiv datorită vitezei de rotație inițial scăzute a moleculei mari), ceea ce va duce la o scădere a preciziei măsurătorii. Gradul de legare este determinat de modificarea anizotropiei între stările libere, parțial legate și complet (în exces de proteine) prin titrare .

Dacă fluoroforul este atașat la o moleculă mare, cum ar fi o proteină sau ARN , schimbarea sa în mobilitate în timpul plierii poate fi utilizată pentru a studia dinamica plierii.

În microscopie, fenomenul de polarizare a fluorescenței poate fi aplicat pentru a studia vâscozitatea locală a citosolului sau a membranelor , pentru a determina microstructura locală a membranelor sau compoziția lipidică . Aceasta folosește polarizatoare situate după sursa de lumină și în fața camerei. Această tehnică poate fi folosită și pentru a studia interacțiunea moleculelor în cascade de semnal ca răspuns la diferite influențe.

Fenomenul emFRET și scăderea asociată a anizotropiei pot fi utilizate în studiul agregării .

Note

  1. ↑ Weber, G., 1953. Mișcarea browniană de rotație și polarizarea fluorescenței soluțiilor. Adv. chimică proteică. 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polarizări și atribuiri de tranziții: metoda de fotoselecție. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.

Literatură