ADN giraza (sau pur și simplu giraza ) este o enzimă a bacteriei E. coli și a altor procariote , aparține grupului de topoizomeraze . Ca reprezentant tipic al topoizomerazelor de clasa II, ADN-giraza introduce rupturi temporare dublu-catene în ADN în timpul ciclului catalitic. O caracteristică unică a ADN-girazei este capacitatea de a introduce în mod intenționat superbobine negative în moleculele de ADN folosind energia hidrolizei ATP .
În 2007, giraza a fost descrisă în protozoarul parazit Plasmodium falciparum din filiala Apicomplexa [1] . Girase a mai fost găsită în cloroplaste și mitocondrii ale unor plante [2] .
ADN-giraza bacteriană este necesară pentru implementarea celor mai importante procese celulare - replicare , diviziune celulară , transcripție [3] . Este ținta multor antibiotice , cum ar fi acidul nalidixic , novobiocina și ciprofloxacina .
ADN giraza a fost descrisă de M. Gellert și colab. în 1976 [4] .
ADN giraza este o enzimă tetramerică formată din două subunități A (GyrA) și două subunități B (GyrB). Din punct de vedere structural, complexul este format din trei perechi de „porți”, a căror deschidere și închidere secvențială duce la transferul direcționat al unui segment de ADN și introducerea a două superbobine negative. N-porțile sunt formate din domeniile ATPazei ale subunităților B. Legarea a două molecule de ATP stimulează dimerizarea și, în consecință, închiderea porții N, în timp ce hidroliza ATP la ADP , dimpotrivă, stimulează deschiderea porții. Poarta ADN-ului conține un centru catalitic care introduce reversibil o rupere dublă catenă în ADN și este formată din toate subunitățile enzimei. Poarta C constă numai din subunitățile A ale girazei [5] . Subunitățile A și B ale ADN-girazei sunt omoloage cu proteinele C și E ale topoizomerazei IV , precum și domeniilor C- și N-terminale ale topoizomerazei eucariote II , respectiv [6] .
În prezent, mecanismul de acțiune al ADN-girazei, numit mecanism de trecere a lanțului, este considerat general acceptat. Conform acestui model, ADN giraza interacționează cu două regiuni funcționale ale segmentelor ADN, T și G. În primul pas, enzima leagă segmentul G și înfășoară ADN-ul în jurul său, formând o supercoilă corespunzătoare supercoilingului pozitiv . Rolul cheie în înfășurarea ADN-ului este jucat de domeniile C-terminale ale subunităților A ( CTD , din domeniile C-terminale engleze). Atașarea a două molecule de ATP duce la închiderea porții N formată din subunitățile B ale enzimei și la legarea segmentului T ADN. Rearanjamentele conformaționale ale complexului provoacă hidroliza primei molecule de ATP și clivajul segmentului G din cauza atacului legăturilor fosfodiester ale acidului nucleic de către tirozinele centrului catalitic al ADN-girazei. În pasul următor, segmentul T este trecut prin ruptura dublu catenă a segmentului G, iar segmentul G este închis înapoi. În etapa finală a ciclului catalitic, segmentul T părăsește enzima prin poarta C formată din subunitățile A ale girazei și a doua moleculă de ATP este hidrolizată [7] . Introducerea a două superbobine negative are loc datorită inversării semnului superbobinei: o superbobină pozitivă formată la începutul ciclului catalitic datorită înfășurării ADN-ului în jurul enzimei, direcționată prin transferul segmentului T printr-un dublu ruptura firului în segmentul G, se transformă într-o superbobină negativă [8] . În termeni matematici, această operație este echivalentă cu schimbarea coeficientului de legătură cu -2. Potrivit unor estimări, viteza girazei ajunge la aproximativ 100 de superbobine pe secundă [9] .
S-a demonstrat că ADN-giraza are o specificitate pronunțată pentru secvențele de ADN. De exemplu, sunt cunoscute situsuri puternice de legare pentru enzima din bacteriofagul Mu și unele plasmide (pSC101, pBR322). Cartografierea situsurilor de legare a ADN-girazelor din genomul E. coli folosind metoda Topo-Seq a relevat un motiv de legare lung (130 nt) care explică existența unor situsuri puternice și reflectă înfășurarea ADN-ului în jurul complexului enzimatic și flexibilitatea acidului nucleic. Analiza motivului a evidențiat regiuni ale ADN-ului care se leagă la domeniile C-terminale ale subunităților A, caracterizate printr-un model periodic de nucleotide al regiunilor bogate în AT și GC cu o perioadă apropiată de cea a dublei helix ADN (~10,5 nt) [ 3] . Anterior, o regularitate similară în motivul de legare a fost găsită pentru nucleozomii eucarioți , în jurul cărora se înfășoară și ADN-ul (146 nt, organizat în 1,8 ture) [10] . În total, câteva mii de situsuri enzimatice au fost găsite în genomul E. coli [3] .
După cum se arată mai sus, gyrase are capacitatea de a relaxa superbobinele pozitive, înlocuindu-le cu unele negative. Acest lucru face giraza extrem de importantă pentru procesele celulare în timpul cărora are loc desfășurarea dublei helix ADN, cum ar fi replicarea și transcripția ADN-ului . Când ADN-ul sau ARN polimeraza se deplasează de-a lungul ADN-ului , superbobinele pozitive se acumulează înaintea enzimei. Tensiunea creată în acest fel împiedică progresul în continuare a enzimei. Această problemă este rezolvată de girază (precum și topoizomeraza IV în cazul replicării), care relaxează superbobinele pozitive. Astfel, giraza joacă un rol important atât în inițierea, cât și în alungirea proceselor de sinteză a șablonului cu ADN [8] .
Giraza este prezentă în procariote și unele eucariote, dar aceste enzime au secvențe de aminoacizi și structuri spațiale diferite la diferite specii. ADN-giraza este absentă la om și, prin urmare, este convenabil să o folosești ca țintă pentru antibiotice. Există două clase de antibiotice care vizează inhibarea girazei:
În plus față de ADN giraza, care induce formarea de superbobine negative, există și giraza inversă , care provoacă formarea de superbobine pozitive, de asemenea, cu cheltuirea energiei de hidroliză ATP . Până acum, giraza inversă a fost găsită exclusiv în arheile hipertermofile și bacterii, în timp ce ADN giraza se găsește predominant în bacteriile mezofile . Au fost înregistrate mai multe cazuri unice când ambele enzime sunt prezente într-un singur organism - aceasta este bacteria hipertermofilă Thermotoga maritima și arhea hipertermofilă Archaeoglobus fulgidus [6] . Prezența girazei inverse în arheile termofile este asociată cu prezența elementelor genetice ( plasmide , ADN viral ) în ele într-o formă unică răsucită pozitiv, în timp ce plasmidele arheilor mezofile și bacteriilor sunt răsucite negativ. Se crede că supraînfăşurarea pozitivă stabilizează suplimentar dubla helix ADN şi previne denaturarea termică a acidului nucleic la temperaturi ridicate [11] .
Giraza inversă este o combinație unică de topoizomerază clasică de tip I și un complex proteic cu proprietăți helicaze [6] .
| Replicarea ADN-ului | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Iniţiere |
| ||||||
| Elongaţie |
| ||||||
| Încetarea |
| ||||||