Tomografia crioelectronică

Criotomografia electronică  ( ECT , de asemenea,   tomografia crio-electronică, crio-ET sau CET ) este o tehnică de imagistică tridimensională de înaltă rezoluție (~4 nm). Folosit pentru a obține imagini ale macromoleculelor și celulelor biologice [1] .

ECT este utilizat cu  microscopia electronică cu transmisie (TEM), în care specimenele sunt înclinate la unghiuri diferite față de un fascicul de electroni, rezultând o serie de imagini bidimensionale. O serie de imagini înclinate 2D sunt procesate pe un computer, rezultând o tomogramă 3D.

Spre deosebire de tehnicile care utilizează  tomografia electronică , în această tehnică, probele studiate sunt înghețate folosind o tehnologie specială, astfel încât obiectul de studiu să nu fie deteriorat de cristale de gheață, presiune, substanțe chimice și alți factori. Această procedură se numește criofixare. De obicei, o probă organică este răcită astfel încât gheața rezultată să fie amorfă (necristalină, deci se efectuează vitrificarea) [2] , iar transiluminarea se realizează în condiții criogenice la temperaturi sub °C, ceea ce previne distrugerea structurilor biologice. [3] .

Descrierea tehnologiei

În microscopia electronică (EM), probele sunt în vid înalt. Un astfel de vid este inaplicabil pentru probele biologice, deoarece apa fierbe în celule și acestea explodează. La temperatura camerei în EM, probele sunt deshidratate. O altă abordare pentru stabilizarea probelor biologice este înghețarea acestora ( microscopie crio-electronică ). În microscopia crio-electronică, specimenele (de obicei celule mici (cum ar fi bacteriile sau Archaea ) sau virușii ) sunt pregătite pentru examinare în medii apoase normale. Probele sunt scufundate într-un criogen (de obicei etan lichid ), în timp ce moleculele de apă nu au timp să se rearanjeze într-o rețea cristalină. Ca urmare a unei astfel de răciri, apa trece în starea de gheață amorfă. [2] Aceasta păstrează structurile celulare, cum ar fi membranele lipidice, care sunt în mod normal distruse de înghețarea convențională. Probele congelate sunt depozitate la  temperatura azotului lichid și apa nu este încălzită suficient pentru a cristaliza.

Probele sunt vizualizate într-un microscop electronic cu transmisie (TEM). Acestea sunt înclinate la diferite unghiuri în raport cu fasciculul de electroni (de obicei la fiecare 1 sau 2 grade de la aproximativ -60° la +60°) pentru a produce imagini la fiecare unghi. O serie de imagini este procesată pe un computer și se obține o imagine tridimensională a obiectului de interes [4] . Imaginea rezultată se numește tomogramă sau reconstrucție tomografică.

Caracteristici

În microscopia electronică cu transmisie (TEM), electronii interacționează cu materialul eșantionului, astfel încât rezoluția este limitată de grosimea acestuia. Probele trebuie să aibă o grosime de cel puțin ~500 nm pentru a obține o rezoluție „macromoleculară” (~4 nm). Din acest motiv, majoritatea cercetărilor ECT s-au concentrat pe studiul complexelor macromoleculare purificate, virușilor și celulelor mici, cum ar fi multe specii bacteriene și Archaea .

Interacțiunea puternică a electronilor cu materia duce la efecte de anizotropie. Când proba este înclinată, fasciculul de electroni interacționează cu o suprafață a secțiunii transversale relativ mare. Acest lucru duce la faptul că, în practică, unghiurile de înclinare mai mari de 60-70° nu oferă multe informații și, prin urmare, nu sunt utilizate.

ECT folosește, de asemenea, microscopia prin criofluorescență [5] , microscopia cu lumină (de exemplu, cryo-Palm [6] ) și alte tehnici. În aceste tehnici, o probă care conține o proteină marcată fluorescent este înghețată și vizualizată la microscop cu lumină. În acest caz, proba trebuie păstrată la temperaturi (sub -150°C). Semnalul fluorescent este identificat și proba este transferată în crio-ET pentru examinare.

Vezi și

Note

  1. ↑ Gan, Lu; Jensen, Grant J. Tomografia cu electroni a celulelor  (nedefinită)  // Revizuiri trimestriale de biofizică. - 2012. - 1 februarie ( vol. 45 , nr. 1 ). - S. 27-56 . — ISSN 1469-8994 . - doi : 10.1017/S0033583511000102 . — PMID 22082691 .
  2. ↑ 1 2 Copie arhivată . Preluat la 8 octombrie 2017. Arhivat din original la 8 octombrie 2017.
  3. ↑ Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, JJ; Homo, JC; Lepault, J.; McDowall, A.W.; Schultz, P. Crio-microscopie electronică a specimenelor vitrificate  (neopr.)  // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1988. - 1 mai ( vol. 21 , nr. 2 ). - S. 129-228 . — ISSN 0033-5835 . - doi : 10.1017/s0033583500004297 . — PMID 3043536 .
  4. ↑ Lucič, Vladan; Rigort, Alexandru; Baumeister, Wolfgang. Tomografia crio-electronică: provocarea de a face biologie structurală in situ  //  Jurnalul de biologie celulară : jurnal. - 2013. - 5 august ( vol. 202 , nr. 3 ). - P. 407-419 . - ISSN 1540-8140 . - doi : 10.1083/jcb.201304193 . — PMID 23918936 .
  5. ↑ Zhang, Peijun. Tomografia crio-electronică corelativă și microscopia optică a celulelor  (engleză)  // Current Opinion in Structural Biology : journal. - 2013. - 1 octombrie ( vol. 23 , nr. 5 ). - P. 763-770 . — ISSN 1879-033X . - doi : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . — PMID 23962486 .
  6. ↑ Chang, Yi-Wei. Microscopie de localizare fotoactivată criogenică corelată și tomografie crio-electronică  (engleză)  // Nature Methods  : journal. - 2014. - 1 iulie ( vol. 11 , nr. 7 ). - P. 737-739 . — ISSN 1548-7105 . - doi : 10.1038/nmeth.2961 . — PMID 24813625 .

Link- uri externe