Microscopia cu fluorescență este o metodă de obținere a unei imagini mărite folosind luminescența atomilor și moleculelor excitate dintr-o probă. Utilizat pe scară largă în știința materialelor și în domeniile biomedicale.
Moleculele sunt capabile să absoarbă cuante de lumină și să treacă în stări excitate electronic. Revenirea unei molecule la starea „normală” (de bază), însoțită de emisia de lumină, se numește fluorescență . Absorbția și fluorescența sunt determinate de structura nivelurilor de energie ale electronilor moleculei și, prin urmare, este o proprietate specifică fiecărui tip de moleculă (vezi detalii în articolul spectroscopie electron-vibrațională ).
Materialul biologic, de regulă, fluoresce foarte slab de la sine, dar datorită utilizării de molecule fluorescente strălucitoare și diverse ( fluorofore ) care pot colora în mod specific diferite structuri ale țesuturilor și celulelor, metoda microscopiei cu fluorescență s-a dovedit a fi foarte valoroasă pentru Stiinte biomedicale.
Metodele tradiționale de microscopie cu fluorescență au o rezoluție semnificativ mai mică în comparație cu microscopia electronică sau cu forță atomică . Cu toate acestea, spre deosebire de acesta din urmă, microscopia optică face posibilă observarea microstructurii interne a celulelor și chiar a organismelor mici, nu numai fixe, ci și vii. Datorită acestui fapt, microscopia cu fluorescență s-a dovedit a fi cea mai bună metodă de studiere a mecanismelor de funcționare a organismelor la nivel celular, subcelular și molecular.
Într-un microscop fluorescent, proba este iradiată cu lumină la o frecvență mai mare , iar imaginea este obținută în spectrul optic. Radiația probei, respectiv, este trecută printr-un filtru care oprește lumina la frecvența de excitație. Imaginea preparatului fluorescent poate fi fotografiată cu o cameră digitală specializată, care permite realizarea de fotografii cu expunere lungă. Pentru unele imagini, acest timp poate fi de până la 60 de minute.
Dezvoltarea intensivă a microscopiei cu fluorescență la începutul secolelor 20 și 21 a condus la dezvoltarea de noi metode - microscopia cu doi fotoni și confocală , precum și o serie de abordări care au făcut posibilă depășirea barierei de difracție a rezoluției optice și atinge nanorezoluția fără precedent.
Unul dintre tipurile de microscopie cu fluorescență este microscopia confocală , o metodă care permite obținerea unei imagini a unui anumit strat al unei probe, scăpând de contribuția straturilor de deasupra și de dedesubt. Astfel, această metodă are o rezoluție comparabilă de-a lungul celor trei axe de coordonate. Un alt tip de microscopie cu fluorescență, microscopia cu epifluorescență, vă permite să examinați suprafața și o zonă îngustă aproape de suprafață a probei.
Microscopia cu fluorescență cu reflexie internă totală (TIRFM) se bazează pe fenomenul de reflexie a undelor electromagnetice de la o interfață între două medii transparente, care apare atunci când o undă este incidentă dintr-un mediu cu un indice de refracție mai mare la un unghi mai mare decât unghiul critic (1). /n). Intensitatea radiației care pătrunde în al doilea mediu scade conform unei legi exponențiale, ceea ce face posibilă detectarea obiectelor fluorescente excitate de această radiație într-un strat limită gros de ~100 nm cu o rezoluție de până la 10 nm [1] . Astfel, TIRFM poate fi considerată pe bună dreptate una dintre metodele de nanoscopie cu fluorescență. În biologie, metoda este utilizată pentru a vizualiza membrana plasmatică și structurile membranei celulelor.
În ultimii ani, în domeniul microscopiei cu fluorescență s-au dezvoltat mai multe abordări noi, care au făcut posibilă depășirea barierei de difracție a rezoluției optice și obținerea de ~10 nm foarte mare. Aceste metode au început să fie unite sub termenul general de nanoscopie cu fluorescență.