Metoda Sanger este o metodă de secvențiere a ADN- ului , cunoscută și ca metoda de terminare a lanțului. Această metodă de secvențiere a fost propusă pentru prima dată de Frederick Sanger în 1977 [1] , pentru care a fost distins cu Premiul Nobel pentru Chimie în 1980. Această metodă este cea mai comună de 40 de ani.
În versiunea clasică a metodei Sanger, una dintre catenele ADN-ului analizat acționează ca un șablon pentru sinteza unei catene complementare de către enzima ADN polimerază . Reacția cu aceeași matrice se desfășoară în patru tuburi diferite, fiecare conținând:
Dideoxiribonucleotidele (ddATP, ddGTP, ddCTP sau ddTTP) nu au o grupare 3’-hidroxil, astfel încât sinteza ulterioară este întreruptă după includerea lor în lanț. Astfel, în fiecare tub se formează un set de fragmente de ADN de lungimi diferite, care se termină în aceeași nucleotidă (conform dideoxinucleotidei adăugate). După terminarea reacției, conținutul tuburilor este separat prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă în condiții de denaturare, iar gelurile sunt autoradiografiate . Produșii a patru reacții formează o „scăriță de secvențiere”, care vă permite să „citiți” secvența de nucleotide a unui fragment de ADN [2] [1] .
Metoda Sanger vă permite, de asemenea, să determinați secvența de nucleotide a ARN-ului , dar mai întâi trebuie să fie „rescrisă” sub formă de ADN folosind transcripția inversă .
Până în prezent, secvențierea ADN-ului conform Sanger este complet automatizată și se realizează pe dispozitive speciale, secvențiere. Utilizarea dideoxinucleotidelor cu etichete fluorescente cu lungimi de undă de emisie diferite face posibilă efectuarea reacției într-o singură eprubetă. Amestecul de reacție este separat prin electroforeză capilară în soluție, fragmentele de ADN care ies din coloana capilară sunt înregistrate de un detector de fluorescență . Rezultatele sunt analizate de calculator și prezentate ca o secvență de vârfuri colorate corespunzătoare la patru nucleotide. Secvențietoarele de acest tip pot „citi” la un moment dat secvențe de 500-1000 de nucleotide în lungime. În comparație, metoda de pirosecvențiere , dezvoltată în 1996, permite o etapă pentru a determina secvența unui număr mult mai mic de nucleotide. Automatizarea a accelerat foarte mult procesul de secvențiere și a permis secvențierea genomilor întregi , inclusiv a genomului uman [2] .