Electroforeza capilară

Electroforeza capilara , cunoscuta si sub denumirea de electroforeza zonala capilara ( CZE ), este folosita pentru a separa ionii prin sarcina . În cazul electroforezei convenționale, moleculele încărcate se mișcă într-un lichid conductor sub influența unui câmp electric . În anii 1960, a fost propusă o tehnică de electroforeză capilară pentru a separa moleculele după sarcină și dimensiune într-un capilar subțire umplut cu un electrolit .

Echipament

Electroforeza capilară necesită un echipament relativ simplu. Schema experimentului este prezentată în Figura 1 . Componentele principale ale sistemului sunt flaconul de aplicare, flaconul de pornire, flaconul final, capilarul, electrozii, sursa de alimentare mare, detectorul și dispozitivul de procesare a datelor. Sticla de aplicare a probei, sticla de început și sticla de final sunt umplute cu un electrolit, cum ar fi o soluție tampon apoasă. Pentru a aplica proba, capătul capilarului este scufundat în flaconul de probă și apoi transferat în flaconul de pornire. Mișcarea substanțelor analizate se realizează sub acțiunea unui câmp electric. Toți ionii se mișcă de-a lungul capilarului într-o direcție sub influența curentului electroosmotic. Analiții sunt separați prin mobilitate electroforetică și sunt detectați aproape de capătul capilarului. [unu]

Detectare

Detectarea moleculelor separate în timpul electroforezei capilare poate fi efectuată prin diferite dispozitive. Cele mai comune dispozitive detectează modificări ale absorbției radiațiilor în regiunea ultravioletă sau în regiunea luminii vizibile. De obicei, în astfel de sisteme, o porțiune a unui capilar este utilizată ca celulă. Lungimea căii luminii transmise în electroforeza capilară este de ordinul a 50 de micrometri, ceea ce este mult mai mică decât în cazul celulelor ultraviolete convenționale, în care lungimea căii luminii este de ordinul a 1 centimetru.

Conform legii Bouguer-Lambert-Beer, sensibilitatea unui detector este proporțională cu lungimea căii pe care lumina o parcurge prin celulă. Pentru a crește sensibilitatea, calea pe care parcurge lumina este prelungită, dar pe măsură ce dimensiunea celulei crește, rezoluția scade. Tubul capilar poate fi extins la locul de detectare, acest tip se numește celulă cu bule. Într-o altă opțiune, o creștere a căii luminii transmise este realizată prin adăugarea unui capilar suplimentar (vezi Figura 2 ). Ambele metode reduc eficiența separării. [2]

Detectarea fluorescenței poate fi utilizată în electroforeza capilară a probelor fluorescente natural sau modificări chimice care introduc etichete fluorescente. Această metodă de detectare oferă o sensibilitate ridicată, dar nu poate fi utilizată pentru a detecta probe nefluorescente. De asemenea, este utilizată detectarea fluorescenței induse de laser, astfel de sisteme de electroforeză capilară pot detecta în intervalul 10 -18 - 10 -21 mol.

Pentru a distinge mostre similare, sistemele de separare prin electroforeză capilară pot fi conectate direct la spectrometrele de masă. În majoritatea acestor sisteme, capătul capilarului este plasat într-un aparat de ionizare cu electroaerosol . Particulele ionizate sunt analizate în continuare prin spectrometrie de masă. [2]

Metode de separare

Moleculele sunt separate prin electroforeză capilară datorită diferențelor de mobilitate într-un câmp electric aplicat. Viteza de mișcare ( ) a moleculelor separate în câmpul aplicat în raport cu electrodul cu sarcina opusă: $u_{p}$

$u_{p}=\mu _{p}E$

unde este mobilitatea electroforetică și E este puterea câmpului electric. Mobilitatea electroforetică este proporțională cu sarcina ionului. În cazul în care proba este formată din două tipuri de molecule care diferă în sarcină, separarea are loc ca urmare a electroforezei. Mobilitatea electroforetică a unei substanțe la valori date de pH este: $\mu _{p}$

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r}}$

unde este sarcina specifică a moleculei și este raza Stokes a moleculei: ${z)$ $r$

$r={\frac {k_{B}T}{6\pi \eta \ D}}$

unde este constanta Boltzmann și temperatura și D este coeficientul de difuzie . Aceste ecuații arată că mobilitatea electroforetică a unei molecule este proporțională cu sarcina și invers proporțională cu raza acesteia. Mobilitatea electroforetică poate fi determinată experimental din momentul mișcării unei molecule într-un câmp electric de o putere dată: $k_B$ $T$

$\mu _{p}=\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)$

unde este distanța de la punctul de pornire la locul de detectare, este timpul necesar moleculei analizate pentru a ajunge la punctul de detecție, este puterea câmpului electric și este lungimea totală a capilarului. [2] Deoarece câmpul electric acționează numai asupra moleculelor încărcate, moleculele neîncărcate sunt slab separate prin electroforeză capilară. $L$ $t_{r}$ $V$ $L_{t)$

Viteza de mișcare a moleculelor analizate în timpul electroforezei capilare depinde de mărimea fluxului electroosmotic din tampon. În general, fluxul electroosmotic este îndreptat către catodul încărcat negativ. Diferite în mobilitățile electroforetice, moleculele se deplasează către electrodul încărcat opus. [1] Particulele încărcate negativ se deplasează către anodul încărcat pozitiv, particulele încărcate pozitiv se deplasează către catod în direcția fluxului electroosmotic (vezi Figura 3 ).

Debitul electroosmotic poate fi reprezentat astfel: $u_{o}$

$u_{o}=\mu _{o}E$

unde este mobilitatea electroosmotică egală cu: $\mu _{o}$

$\mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}$

unde este potențialul peretelui capilar și este permisivitatea relativă a soluției tampon. Mobilitatea electroosmotică poate fi determinată prin măsurarea timpului de întârziere al moleculelor încărcate neutru. [2] Viteza de mișcare ( ) a moleculei analizate într-un câmp electric poate fi reprezentată ca: $\zeta$ $\epsilon$ $u$

$u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E$

Datorită faptului că debitul electroosmotic al soluției tampon este de obicei mai mare decât fluxul electroforetic al substanțelor analizate, toate moleculele analizate se deplasează cu soluția tampon la catod. Moleculele încărcate negativ rămân mai mult timp în capilar din cauza contradicțiilor în mobilitățile lor electroforetice. [1] Ordinea de mișcare a moleculelor încărcate este prezentată în Figura 3 : cationii mici se mișcă rapid, anionii mici cu încărcare multiplicată sunt puternic întârziați. [2]

Eficiență și rezoluție

Numărul de plăci teoretice, sau eficiența de separare în cazul electroforezei capilare, este dat de ecuația:

$N={\frac {\mu V}{2D_{m}}}$

unde este numărul de plăci teoretice, este mobilitatea aparentă în mediul de separare și este coeficientul de difuzie al substanței de separat. Conform acestei ecuații, eficiența separării este limitată doar de difuzie și este proporțională cu puterea câmpului electric. Eficiența separării prin electroforeză capilară este în general mult mai mare decât cea a altor metode de separare, cum ar fi cromatografia lichidă de înaltă performanță . Spre deosebire de HPLC, în cazul electroforezei capilare nu există transfer de masă între faze. [2] Profilul de curgere în cazul sistemelor cu flux electroosmotic este plat, în contrast cu profilul laminar al coloanelor cromatografice în care separarea are loc sub presiune (vezi Figura 5 ). Ca rezultat, în timpul separării electroosmotice, dilatarea benzii nu are loc, ca în cromatografie. Separarea prin electroforeză capilară poate avea câteva sute de mii de plăci teoretice. [3] $N$ $\mu$ $D_{m)$

Rezoluția ( ) a separării electroforezei capilare poate fi scrisă astfel: $R_{s}$

$R_{s}={\frac {1}{4)}\left({\frac {\triunghi \mu _{p}{\sqrt {N)}}{\mu _{p}+\ mu _{o}}}\right)$

În conformitate cu această ecuație, rezoluția maximă se atinge la valori similare ale mobilităților electroforetice și electroosmotice, dar cu semnul opus. În plus, rezoluția înaltă necesită viteză mică și, în consecință, necesită mai mult timp de separare. [2]

Metode înrudite

Separarea prin electroforeză capilară se bazează pe diferențele în mobilitățile electroforetice ale moleculelor care trebuie separate. Cu toate acestea, unele clase de molecule nu pot fi separate deoarece sunt neîncărcate sau diferă ușor în mobilitatea electroforetică. Pentru a separa componentele probelor neutre (neîncărcate), se utilizează cromatografia electrocinetică micelară (MEKC) , în care agenții tensioactivi sunt adăugați la soluția tampon pentru a forma micelii . Polimerii încărcați, cum ar fi ADN-ul, pot fi separați în capilare umplute cu gel; gelul încetinește mai mult moleculele mai lungi decât pe cele mai scurte. Această variantă de electroforeză capilară se numește electroforeză pe gel capilar. Unele sisteme de electroforeză capilară pot fi utilizate pentru cromatografia la microscală. De asemenea, sistemele de electroforeză capilară pot fi utilizate pentru izotachoforeză , focalizare izoelectrică și electroforeză de afinitate .

Note

↑ 1 2 3 4 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. „Principiile analizei instrumentale” ed. a VI-a. Editura Thomson Brooks/Cole: Belmont, CA 2007 .
↑ 1 2 3 4 5 6 7 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. „Principiile analizei instrumentale” ed. a VI-a. Capitolul 30 Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ Skoog, D.A.; Holler, FJ; Nieman, TA „Principiile analizei instrumentale, ed. a 5-a”. Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998 .

Literatură

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chim . 1984 , 56 , 111.
Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chim . 1984 , 56 , 113.
Foley, JP Anal. Chim . 1990 , 62 , 1302.
Carretero, AS; Cruces-Blanco, C.; Ramirez, S.C.; Pancorbo, AC; Gutierrez, A. F. J. Agric. alimente. Chim . 2004 , 52 , 5791.
Cavazza, A.; Corradini, C.; Laura, A.; Nicoletti, I. J. Agric. chimie alimentară . 2000 , 48 , 3324.
Rodrigues, MRA; Caramao, EB; Arce, L.; Rios, A.; Valcarcel, M. J. Agric. chimie alimentară . 2002 , 50 , 4215.

Vezi și

electroforeză