Toxina holeră ( colerogen [1] ) este o exotoxină proteică cu mai multe subunități produsă de Vibrio cholerae . Vibrio (o tulpină virulentă de Vibrio cholerae [1] [2] secretă toxina holerica după ce bacteria pătrunde în corpul uman. Acțiunea CT provoacă deshidratare intensă după debutul fazei active a infecției holerice . La pătrunderea în celulele unui organism infectat, una dintre subunitățile acestei toxine catalizează ADP-ribozilarea Gsα-componentă a adenilatciclazei , ceea ce duce la hiperactivarea acesteia [2] .. Activitatea crescută a adenitalciclazei duce la perturbarea transportului ionic prin membrana celulelor intestinale : aportul a ionilor de sodiu (și odată cu aceștia apă) scade și debitul de anioni (și odată cu ei apă) crește. Ca urmare, are loc o pierdere rapidă de apă de către celulele intestinale, care în unele cazuri ajunge la doi litri pe oră.
Toxina holeră este o proteină oligomerică formată din șase subunități. Una dintre aceste subunități este de tip A. Această subunitate are activitate catalitică. Celelalte cinci subunități sunt de tip B. Sunt necesare pentru legarea toxinei holerice de proteina receptorului celular uman. Structura spațială a toxinei holerice a fost obținută de Zhang și colab. (Zhang et al.) în 1995.[3] Subunitățile B ale toxinei holerice sunt proteine mici. Greutatea moleculară a subunității B este de 12 kDa. În molecula toxinei holerice, subunitățile B formează un inel. În subunitatea A se disting două domenii legate printr-o legătură disulfurică: A1 (CTA1) este o enzimă care leagă ADP-riboza de proteinele G, A2 (CTA2) are forma unei elice alfa, care este situată în interiorul celor cinci -inel cu membri format din subunități B. [ patru] Structura toxinei holerice, mecanismul catalitic și secvența sunt similare cu toxina coli.
Toxina holerica intră în celulele epiteliale intestinale (enterocite) prin endocitoză dependentă de receptor . În citoplasma celulei, legătura disulfură dintre domeniile A1 și A2 este restabilită și A1 (CTA1) se disociază de complex. Subunitatea A1 are capacitatea de a atașa ADP-riboză la componenta trimerică Gsa a adenilat-ciclazei. Ca rezultat al acestei reacții, adenilat ciclaza este activată și începe să sintetizeze cAMP. La rândul său, cAMP începe calea de semnalizare , care duce la ieșirea ionilor de clorură și a altor anioni din celulă prin canalele CFTR și la încetarea pătrunderii ionilor de sodiu în celulă. Ieșirea suplimentară a ionilor de sodiu are loc împreună cu anionii. Ionii de sodiu sunt cotransportați cu moleculele de apă, astfel încât concentrația de apă în celulă în timpul acestor procese este redusă semnificativ. Încălcarea echilibrului apă-sare duce la diaree, în care organismul pierde până la 2 litri de apă pe oră. Are loc deshidratarea, iar scaunul pacientului capătă consistența caracteristică de „apă de orez” datorită enterocitelor separate de peretele intestinal. În special, toxina pertussis (de asemenea o proteină AB5 cu cinci subunități) produsă de Bordetella pertussis acționează asupra corpului uman într-un mod similar, cu excepția faptului că toxina pertussis atașează ADP-riboza de subunitatea Gαi, menținând-o într-o stare inactivă. Inactivitatea Gαi previne inhibarea adenilat-ciclazei umane și crește sinteza cAMP în celulă [6].
După secreție, subunitatea B a toxinei holerice se leagă de gangliozidul GM1 situat pe membrana celulară exterioară a enterocitelor. După legare, toxina holeră (întregul complex) intră în celulă prin endocitoză. În această etapă, inelul este distrus și, datorită restabilirii legăturilor disulfurice, este eliberat domeniul CTA1, care anterior făcea parte din subunitatea A. Endozomul pătrunde în aparatul Golgi, unde CTA1 interacționează cu chaperona reticulului endoplasmatic, proteina. izomeraza disulfură, se desfășoară și este transportată de către însoțitor în regiunea membranei celulare prin canalul Sec61. În membrană, CTA1 interacționează cu oxidoreductaza Ero1, CTA1 este eliberată din complexul cu chaperonă datorită oxidării și se pliază astfel încât să se evite ubiquitinarea de către enzimele celulare și distrugerea ulterioară. CTA1 se leagă apoi de factorul 6 de ribozilare ADP (Arf6), care stimulează activitatea catalitică a CTA1. Astfel, complexul de CTA1 și Arf6 scindează NAD și transferă ADP-riboza rezultată la proteina G, subunitatea de reglare a adenilatciclazei endogene. Acest lucru duce la faptul că Gαs își păstrează capacitatea de a lega GTP, dar își pierde capacitatea de a-l hidroliza, adică rămâne într-o stare activată. Ca rezultat, cAMP se acumulează în celulă. În general, concentrația sa poate crește de peste 100 de ori.
Gena care codifică toxina holeră poate să fi apărut în V. cholerae prin ceea ce este cunoscut sub numele de transfer orizontal de gene . Tulpinile virulente de Vibrio cholerae sunt infectate cu bacteriofagul CTXf sau CTXφ ;.[7]
În ciuda numelui său formidabil, toxina holeră are o utilizare destul de pașnică. În domeniul cercetării celulelor stem, toxina holeră este utilizată pe scară largă ca aditiv în mediile de cultură . Acest lucru este necesar pentru a preveni diferențierea celulelor și pentru a menține un anumit nivel de proliferare în cultura celulară . Concentrația toxinei holerice în mediul de cultură este de 0,1 nmol/L.
Subunitatea B, care nu este ea însăși citotoxică , este folosită ca trasor. Esența metodei este că o etichetă sau un anticorp fluorescent (o moleculă de imunoglobulină G ) este cusută chimic la subunitatea B. Prin legarea la o celulă care poartă o anumită gangliozidă , subunitatea B modificată etichetează celula.
Patogenitatea toxinei holerice ca atare sub formă de soluție, aerosol etc. pare a fi îndoielnică. Proteina ca atare nu este produsă in vivo în absența vibrionului, efectul său asupra celulelor este semnificativ limitat în timp și, ca toate celelalte proteine, este supusă degradării în tractul digestiv.
Pe piata produselor biologice , toxina holerica se vinde in loturi mici, cum ar fi Sigma-Aldrich , in pachete de 10 mg, ceea ce reduce la minimum riscul utilizarii sale intentionate sau inadecvate in afara zidurilor unui laborator stiintific.