DNază-seq

Testarea sensibilității la DNase-Seq sau la DNază  este o metodă biologică moleculară, împreună cu FAIRE-Seq , utilizată pentru a determina poziția regiunilor de reglementare. Metoda se bazează pe secvențierea regiunilor hipersensibile la scindarea ADNazei I. DNase-Seq este utilizat pentru a determina distribuția globală a situsurilor de scindare a ADNazei I și, prin urmare, cromatina deschisă, unde elementele de reglare sunt adesea localizate. DNase-Seq este deosebit de atractiv pentru identificarea elementelor de reglare deoarece nu se bazează pe prezența sau specificitatea anticorpilor.

Justificare teoretică

Ambalarea ADN-ului în nucleozomi joacă un rol structurant și este un factor important pentru transcripție care determină capacitatea ADN-ului de a se lega de proteine. Acest lucru facilitează replicarea și coordonarea activității genelor [1] .

Vorbind despre accesibilitatea cromatinei, se disting două dintre conformațiile sale - deschise și închise. Conformația închisă corespunde ADN-ului împachetat în nucleozomi și structuri de ordin superior. Studiile timpurii au arătat că regiunile ADN din afara nucleozomului (conformația deschisă) sunt hipersensibile la DNaza I și sunt responsabile de activarea genelor [2] [3] [4] [5] [6] . În ultimii 25 de ani, sute de site-uri hipersensibile au fost identificate prin Southern blot convențional. Cartografierea acestor situri a adus o contribuție semnificativă la identificarea diferitelor tipuri de elemente de reglementare ale genomului - promotori, amplificatori, amortizoare și izolatori. Identificarea elementelor active de reglare a genelor este necesară pentru înțelegerea reglării proceselor biologice la nivelul transcripției [7] . Aceste procese includ diferențierea, dezvoltarea, proliferarea celulelor și răspunsul lor la influențele mediului.

Metoda DNase-seq, descrisă pentru prima dată în 2008, se bazează pe scindarea selectivă de către DNaza I a acestor regiuni importante pentru reglarea proceselor biologice care nu fac parte din nucleozomi.

Procedura

• cultura celulara omogena
• trifosfați deoxinucleozidici
• boabe de streptavidină
• linkerii sunt secvenţe de oligonucleotide recoapte
• primer de secvențiere
• primeri pentru PCR
• ADN ligaza T4
• ADN polimeraza T4

1. Izolarea nucleelor
   • După centrifugare și spălare cu un tampon de aproximativ 50 de milioane de celule, suspensia rezultată este bine amestecată cu tampon de liză.
   • Colorați cu albastru Trypan pentru a verifica calitatea lizei. Dacă liza a avut succes, 99% din celule ar trebui să se coloreze.
   • Se centrifugă pentru a peletiza nucleele și se îndepărtează complet supernatantul.
2. Digestia ADN-ului I și încorporarea ADN-ului în agaroză
3. Identificarea produselor de tratare a DNazelor prin electroforeză în PFG (pulse field gel).
4. Tocirea capetelor proeminente rezultate
5. Crearea unei biblioteci. Două perechi de secvențe de oligonucleotide sunt recoapte pentru a crea doi linkeri. Capetele tratate cu ADNază sunt apoi legate la unul dintre linkeri. După aceea, linkerii nelegați ar trebui să fie separați de ADN-ul ligat și izolați unul de celălalt.

ADN-ul ligat este apoi tratat cu endonuclează de restricție Mmel, rezultând capete defosforilate. Ele trebuie să fie legate la un al doilea linker (fosforilat).

Astfel, se obține un produs DNază-seq. Este amplificată și electroforeza se efectuează cu produsul de amplificare.

După cartografierea citirilor, zgomotul de fundal din digestia aleatorie cu DNaza I (care este de obicei mult mai slab decât cel real) este eliminat prin compararea semnalului din acea poziție cu o regiune mare de flancare și semnalul de fundal așteptat. Granițele clare dintre DHS-urile vecine sunt netezite în programe precum F-seq [8] , bazate pe algoritmi precum HotSpot, optimizați pentru lucrul cu date obținute folosind diferite protocoale [9] [10] [11] .

• Metoda funcționează numai pentru mostrele proaspăt preparate și exclude utilizarea probelor congelate sau fixate în alt mod.
• Timpul de liză și concentrațiile de detergent trebuie optimizate pentru a obține eficiența maximă a lizei și pentru a menține majoritatea nucleelor ​​intacte. În cazul unei lize reușite, numărul de nuclee obținute în comparație cu numărul inițial de celule ar trebui să fie între 80-100%.
• Screeningul mărimii înainte și în timpul construcției bibliotecii influențează direct prezentarea site-urilor ADNazei I puternice și slabe.
• Monitorizarea eficienței de îmbogățire și specificității ADNazei I prin PCR cantitativă sau Southern blot este importantă pentru îmbunătățirea datelor obținute. Pe baza acestor date, concentrația de DNază I poate fi ajustată pentru a obține o îmbogățire optimă.

• Conform metodei, se recomandă analiza a 50 de milioane de celule. Ce să faci dacă nu sunt suficiente celule?
  • Experimentele au fost efectuate și cu un număr mai mic de celule. Este posibil să se recalculeze concentrațiile și volumele proporțional cu numărul de celule, cu toate acestea, în general, toate proporțiile sunt determinate empiric pe baza numărului și tipului de celule.
• Celulele au fost prost lizate insuficient sau, dimpotrivă, excesiv. Liza excesivă a celulelor poate duce la aderarea și precipitarea acestora.
  • Este necesar să alegeți concentrația corectă a agentului de lizare. Diferitele linii celulare au sensibilitate diferită la astfel de agenți. Ar trebui testate diferite concentrații pe un număr mic de celule (5 milioane).
• ADN-ul nu a fost tăiat complet sau excesiv de DNază.
  • Ca si in cazul lizei, concentrarea joaca un rol decisiv. Dacă tăierea nu este suficient de eficientă, creșteți concentrația de enzime sau timpul de procesare sau luați un număr mai mic de celule. În caz de supraprocesare, efectul ADNazei trebuie redus și trebuie luat la o concentrație mai mică.

Comparație cu alte metode

Datele DNase-seq se corelează cu datele DNase-ChIP. Rezultatele obţinute prin ambele metode se corelează cu rezultatele PCR cantitative [12] . Cu toate acestea, există multe diferențe între aceste metode. DNase-seq, spre deosebire de DNase-ChIP, este folosit doar pentru experimente cu întreg genom. DNase-ChIP este mai puțin precis, dar mai flexibil și poate fi utilizat pentru a studia regiuni individuale ale genomului.

DNase-seq este o metodă directă aplicabilă celulelor de orice tip din orice specie al cărei genom a fost secvențiat [13] . DNase-seq este foarte convenabil pentru identificarea elementelor reglatoare ale genomului în prima aproximare. Cu toate acestea, această metodă nu explică în mod direct funcțiile biologice ale acestor elemente. Alte metode, cum ar fi imunoprecipitarea cromatinei , trebuie utilizate pentru a determina funcțiile elementelor de reglare .

Există algoritmi bioinformatici care pot procesa date experimentale brute și pot efectua o analiză mai amănunțită a genomului. De exemplu, până la o nucleotidă, este posibil să se determine locurile în care ADN-ul s-a legat de proteine, așa-numitele. urme de proteine ​​[14] . Dacă urmele de proteine ​​și situsurile hipersensibile sunt grupate în grupuri cu funcții biologice mai clare și corelate cu datele privind secvențele de reglare a genomului, se poate concluziona cum accesibilitatea cromatinei afectează interacțiunea ADN-ului cu factorii de transcripție.

Există un server disponibil public care conține date DNase- și ChIP-seq pentru oameni și șoareci.

Proiect ENCODE

Unul dintre obiectivele proiectului ENCODE este de a mapa toate site-urile hipersensibile din genomul uman pentru a sistematiza ADN-ul de reglementare [15] . Folosind secvențierea cu randament ridicat, a fost obținut un profil de situsuri hipersensibile pentru 125 de tipuri de celule umane. Ca rezultat, au fost identificate 2,9 milioane de site-uri hipersensibile. 34% au fost specifice fiecărui tip de celulă și doar o cantitate mică a fost găsită în toate tipurile de celule. Aceste date dau o idee despre marea complexitate a reglării expresiei în genomul uman și numărul de elemente care controlează această reglare [16] .

Dacă și în ce măsură DNase-seq poate înlocui ChIP-seq este o chestiune pentru cercetări viitoare.

Note

1. ↑ Cockerille P.N. Structura și funcția situsurilor de hipersensibilitate cromatinei active și ADNazei I   // FEBSJ . - 2011. - Nr. 277 . — P. 2182–2210 .
2. ↑ Wu C. Capetele 5’ ale genelor de șoc termic Drosophila din cromatină sunt hipersensibile la DNaza I   // Nature . - 1980. - Iss. 286 . - P. 854-860 .
3. ↑ Wu C, Wong YC, Elgin SC. Structura cromatinei genelor specifice: II. Perturbarea structurii cromatinei în timpul activității genelor   // Cell . - 1979. - Iss. 16 . - P. 807-814 .
4. ↑ Levy A, Noll M. Structura fină a cromatinei a genelor active și reprimate   // Nature . - 1981. - Iss. 289 . — P. 198-203 .
5. ↑ Gross DS, Garrard WT. Situri hipersensibile la nucleaze în cromatina  //  Annu Rev Biochem. - 1988. - Iss. 57 . — P. 159-197 .
6. ↑ Keene MA, Corces V, Lowenhaupt K, Elgin SC. Siturile hipersensibile la ADNza I din cromatina Drosophila apar la capetele 5’ ale regiunilor de transcripție  //  Proc Natl Acad Sci. - 1981. - Iss. 78 . - P. 143-146 .
7. ↑ Song L. și Crawford G.E. DNase-seq: o tehnică de înaltă rezoluție pentru cartografierea elementelor de reglare a genelor active de-a lungul genomului din celulele de mamifere  (engleză)  // ColdSpringHarb.Protoc.. - 2010. - P. 1-11 .
8. ↑ Boyle, A.P., Guinney, J., Crawford, G.E., Furey, T.S. F-Seq: un estimator de densitate a caracteristicilor pentru etichete de secvență de mare randament   // Bioinformatică . - 2008. - Nr. 24 . — P. 2537–2538 .
9. ↑ Sabo, PJ și colab. Descoperirea elementelor funcționale necodante prin analiza digitală a structurii cromatinei   // Proc . Natl. Acad. sci. STATELE UNITE ALE AMERICII. - 2004. - Nr. 101 . — P. 16837–16842 .
10. ↑ Hardison, RC, Taylor, J. Genomic approaches to finding cis-regulatory modules in animals   // Nat . Rev. Genet. - 2013. - Nr. 13 . - P. 469-483 .
11. ↑ Zeng, W, Mortazavi, A. Considerații tehnice pentru testele de secvențiere funcțională  //  Nature Immunology. - 2012. - Nr. 13 . - P. 802-803 .
12. ↑ Boyle AP, Davis S, Shulha HP, Meltzer P, Margulies EH, Weng Z, Furey TS, Crawford GE. Cartografierea și caracterizarea de înaltă rezoluție a cromatinei deschise în întregul genom   // Celulă . - 2008. - Nr. 132 . - P. 311-322 .
13. ↑ Madrigal P, Krajewski P. Abordări bioinformatice actuale pentru a identifica site-urile hipersensibile la DNase I și amprente genomice din datele DNase-seq  //  Frontiers in genetics. - 2012. - Nr. 3 . - P. 1-3 .
14. ↑ Hesselberth JR, Chen X, Zhang Z, Sabo PJ, Sandstrom R, Reynolds AP, Thurman RE, Neph S, Kuehn MS, Noble WS. Cartografierea globală a interacțiunilor proteină-ADN in vivo prin amprenta genomică digitală  //  Metode Nat. - 2009. - Nr. 6 . — P. 283-289 .
15. ↑ Thurman RE și colab. Peisajul cromatinic accesibil al genomului uman   // Natura . - 2012. - Nr. 489 . — P. 75-82 .
16. ↑ Zhang, W și colab. Identificarea la nivel de genom a elementelor de reglementare ADN și a amprentelor de legare a proteinelor folosind semnăturile cromatinei deschise în Arabidopsis  //  Celula vegetală. - 2012. - Nr. 24 . — P. 2719-2731 .