Marker ADN

Markerii ADN (markeri ADN) sau markerii genetici moleculari sunt o trăsătură polimorfă detectată prin metode de biologie moleculară la nivelul secvenței de nucleotide ADN pentru o anumită genă sau pentru orice altă parte a cromozomului atunci când se compară genotipurile diferitelor indivizi, rase. , soiuri, linii.

În ultimii ani, s-au acumulat o mulțime de date privind eficacitatea utilizării markerilor genetici moleculari atât la nivelul proteinelor, cât și al ADN-ului , ARN -ului , pentru rezolvarea multor probleme de genetică, reproducere, conservare a biodiversității, studierea mecanismelor de evoluție, cartografierea cromozomilor, precum și pentru producția și reproducerea semințelor.

Cei mai folosiți markeri genetici moleculari pot fi împărțiți condiționat în următoarele tipuri - markeri ai secțiunilor de gene structurale care codifică secvențe de aminoacizi ale proteinelor ( variante electroforetice ale proteinelor ), markeri ai secțiunilor necodificatoare ale genelor structurale și markeri ai diferitelor ADN. secvențe, relația cărora cu genele structurale este de obicei necunoscută. - distribuția repetăților scurte în tot genomul ( RAPD - ADN polimorf amplificat  aleatoriu ; ISSR  - repetări inversate; AFLP  - polimorfismul site-ului de restricție ) și loci microsateliți ( repetări în tandem cu o unitate elementară lungime de 2-6 nucleotide).

Există o întreagă gamă de tehnologii moderne pentru detectarea polimorfismului la nivel de ADN, dintre care se pot distinge următoarele:

• analiza polimorfismului de lungime a fragmentului de ADN de restricție (RFLP);
• analiza polimorfismului folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR) și alte metode bazate pe amplificarea ADN-ului între secvențele repetate din ADN-ul genomic.

Markeri bazați pe sonde ADN

• RFLP (markeri RFLP, de la „ polimorfism de lungime a fragmentului de restricție ”). Evaluarea polimorfismului în lungimile fragmentelor restrictive de ADN poate fi efectuată în moduri diferite, dar cea mai tradițională metodă este utilizarea hibridizării blot) [1] . Această metodă include izolarea ADN-ului, obținerea fragmentelor de restricție, separarea lor electroforetică, transferul pe filtre, urmată de hibridizarea sondelor ADN specifice cu fragmentele de ADN obținute. O sondă ADN este o secvență relativ scurtă de ADN donat cu un anumit nivel de omologie și capacitatea de a hibridiza cu regiunea corespunzătoare a ADN-ului genomic. Combinațiile de enzime de restricție și sonde dau spectre polimorfe foarte reproductibile ale fragmentelor de ADN specifice fiecărui individ. Diferențele dintre acestea din urmă se pot datora, de exemplu, mutațiilor care modifică locul de restricție. RFLP are o serie de avantaje importante, inclusiv reproductibilitatea ridicată a spectrelor în diferite laboratoare, „comportamentul” co-dominant al markerului. RFLP este eficient în cartografierea genomului, marcarea genelor pentru multe trăsături biologice și economice importante.
• VNTR ( English  Variable Number Tandem Repeat ) este o metodă numită ADN fingerprinting („amprente digitale”) [2] . Repetările tandem sunt larg distribuite în diferite genomi și sunt foarte polimorfe. Ca urmare a variabilității mari a acestor regiuni ADN, analiza RFLP cu sonde pentru secvențe micro și minisateliți face posibilă obținerea de spectre multilocus de înaltă rezoluție la nivel de populație. Datorită nivelului foarte ridicat de polimorfism, această abordare este în prezent un instrument bun pentru analiza variabilității intra și interpopulaționale și determinarea distanțelor genetice între grupuri de organisme. Variantele alelice VNTR sunt moștenite codominant.

Markeri PCR

Metoda reacției în lanț a polimerazei (PCR) implică utilizarea unor primeri specifici și producerea de produse discrete de amplificare a ADN-ului din secțiuni individuale de ADN genomic. Un număr mare de tehnologii conexe sunt construite pe acest principiu. Cea mai utilizată tehnologie RAPD se bazează pe analiza fragmentelor de ADN polimorf amplificate folosind primeri unici cu o secvență de nucleotide arbitrară [3] , [4] , [5] .

• SSR ( în engleză  Simple Sequence Repeats ) - PCR cu primeri de flancare la o repetare scurtă de mini-sau microsatelit vă permite să identificați markeri cu moștenire codominantă și, în consecință, este convenabilă pentru identificarea heterozigoților pentru un anumit locus. Cu toate acestea, o pereche de primeri de flanc PCR permite luarea în considerare a unui singur polimorfism de locus. Pentru mulți loci de microsateliți, nu este posibil să se detecteze polimorfismul. De regulă, secvențele de flancare pentru un anumit locus de microsateliți sunt specifice speciei.
• RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) este o  reacție în lanț a polimerazei care utilizează un singur primer scurt (de obicei 10-mer) cu o secvență de nucleotide arbitrară [6] , [7] . Secvența primerului nu este absolut arbitrară, dar este limitată de valorile compoziției GC de 40-70% și de complexitatea lingvistică a secvenței de nucleotide de 50-100%. Un singur primer sau mai mulți primeri RAPD pot fi utilizați în RAPD. Produsul RAPD este generat prin amplificarea unui fragment de ADN genomic flancat de secvența inversată a primerului utilizat. Metoda este universală pentru studiile diferitelor specii, folosind aceiași primeri. În general, un primer care prezintă polimorfism ridicat la o specie va fi eficient și la alte specii.
• ISSR ( Inter Simple Sequence Repeats ) [8] [9] este o   versiune specializată a metodei RAPD, în care primerul constă dintr-o secvență de microsateliți. Această metodă, ca și RAPD, utilizează unul sau mai mulți primeri cu lungimea de 15-24 de nucleotide. Dar, în acest caz, primerii constau din repetări de 2-4 nucleotide scurte în tandem, de exemplu, 5'- CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G , şi una sau două nucleotide selective la capătul 3' al primerului. Produsele de amplificare ISSR conțin o secvență de primer microsatelit inversată pe flancuri. Deoarece în această metodă secvența primerului este specifică și selectată mai strict decât în ​​RAPD, recoacere PCR poate fi efectuată la o temperatură mai mare (55-60°C) decât pentru metoda RAPD și, prin urmare, amprenta este de obicei mai bine reproductibilă.
• AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) [10]  este o tehnologie care este o combinație de metode RFLP și PCR .  AFLP este o metodă complexă care constă din mai multe etape: ADN-ul genomic este restricţionat simultan de două endonucleaze de restricţie ( EcoRI şi MseI ), recunoscând 4, respectiv 6 baze, rezultând fragmente cu capete 3' suprapuse. ADN-ul genomic restricţionat este apoi legat la un adaptor care conţine capete "lipicioase" pentru situsurile de restricţie ( EcoRI şi MseI ). După aceea, se efectuează două PCR consecutive. Prima PCR (preamplificare) folosește primeri care sunt complet complementari cu adaptoarele EcoRI și MseI . După prima PCR, se formează un număr mare de produse de amplificare între adaptoarele EcoRI și MseI , care sunt dificil de diferențiat folosind electroforeză. Prin urmare, în a doua PCR, primerii cu adaptori EcoRI și MseI conțin la capătul 3’ adaptori suplimentari și necomplementari de la 1 la 3 baze pentru amplificarea selectivă. Separarea fragmentelor de ADN se realizează într-un gel de poliacrilamidă, cu etichetă radioactivă sau respectiv fluorescentă.
• SSAP ( Sequence Specific Amplification Polymorphism ) [11] a fost o  modificare a metodei AFLP pentru a detecta polimorfismul atât la locul de restricție, cât și la inserție.[ clar ] în ADN - ul genomic al unui transpozon sau retrotranspozon . ADN-ul genomic al probelor studiate este scindat cu enzimele de restricție PstI și MseI și se obțin fragmente cu capete 3' proeminente. ADN-ul restricţionat este apoi legat de adaptoarele PstI şi MseI . Prima reacție în lanț a polimerazei (preamplificare) este efectuată cu primeri de la adaptoarele PstI și MseI , adică toate combinațiile posibile ale acestor adaptori în ADN-ul genomic restricționat sunt amplificate. După prima PCR, se formează un număr mare de produse de amplificare a fragmentelor de ADN localizate între primeri și adaptori. Produsele PCR sunt diluate și utilizate pentru o a doua PCR selectivă. A doua PCR este efectuată cu primerul LTR marcat și orice primer adaptor, fie cu Pstl , fie cu MseI . A doua PCR poate utiliza primeri la adaptor cu nucleotide suplimentare la capătul 3', de exemplu, una, două sau trei nucleotide care nu sunt complementare adaptorului. Electroforeza după a doua PCR este efectuată într-un gel de poliacrilamidă sau într-un secvențior dacă a fost utilizată o etichetă fluorescentă. Produsele de amplificare după a doua PCR sunt formate ca rezultat al amplificării fragmentului de ADN între secvența LTR a retrotransposonului și adaptor. Obținerea produselor de amplificare între numai secvențele LTR este în mod fundamental posibilă, dar, de regulă, distanța dintre doi retrotranspozoni este mai mare decât dimensiunile produselor PCR obținute în mod obișnuit (2500-3000 perechi de baze). Și produsele de amplificare între adaptoare nu vor fi detectate, deoarece este folosită doar eticheta pentru primerul LTR.
• Copie de arhivă IRAP din 30 octombrie  2016 la Wayback Machine  ( Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism ) [12] [13]  este o reacție în lanț a polimerazei între primeri complementare secvențelor a două LTR -uri retrotranspozone adiacente . Metoda are mai multe opțiuni. Prima versiune a IRAP folosește un singur primer de la LTR. Produșii de amplificare se formează între două LTR inversate cu aceeași secvență, adică într-o catenă, capătul 5’ al unui LTR este orientat spre capătul 3’ al celuilalt LTR. Dacă partea centrală a retrotransposonului este mai lungă decât dimensiunea obișnuită a produselor PCR (aproximativ 3000 de perechi de baze), atunci PCR va rula doar între două LTR-uri din retrotranspoziții diferite. În acest caz, LTR-urile adiacente trebuie să fie inversate. O altă versiune a IRAP utilizează doi primeri diferiți pentru LTR-urile inversate: un primer la capătul 5’ și celălalt la capătul 3’ al LTR, orientat departe de retrotransposon. În acest caz, LTR-urile adiacente sunt aranjate ca repetări lungi directe. Și, în sfârșit, în cea de-a treia versiune a IRAP sunt utilizați primeri LTR din retrotrapozoni diferiți în orientări diferite. Puteți combina primeri din LTR cu alți primeri din ADN repetitiv.
• REMAP ( Retrotransposone  Microsatellite Amplified Polymorphism ) [12] [13]  este o reacție în lanț a polimerazei între un primer pentru fragmentul LTR al unui retrotransposon și un primer dintr-un microsatelit simplu din apropiere (primer ISSR). În acest caz, poziția fragmentului retrotranspozon amplificat este „ancorată” prin utilizarea unui primer la locusul microsatelit. De exemplu, în plante, este convenabil să se utilizeze un primer LTR și un primer microsatelit (5'- CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G ) cu o singură nucleotidă selectivă la capătul 3' al primerului. REMAP utilizează variante de primer LTR atât pentru capătul 5’ cât și pentru capătul 3’ al LTR, ca în IRAP.
• RBIP ( Retrotransposon  -Based Insertion Polymorphisms ) [14]  este o metodă bazată pe utilizarea primerilor pentru secvențele de retrotranspozon și dezvăluirea variantelor alelice codominante. Principiul său se bazează pe PCR multilocus, care utilizează o pereche de primeri care flanchează regiunea ADN înainte de retrotranspunere și un primer la LTR al retrotransposonului, care este inserat în această regiune între primii doi primeri. Ca urmare a PCR, una dintre variantele fragmentelor flancate de o pereche de primeri va fi amplificată, deoarece secvența dintre LTR-uri este prea lungă pentru PCR între situsurile ADN genomic cu un retrotranspozon în interior. Această metodă detectează polimorfismul numai pentru un loc polimorf dat. Avantajele sale includ codominanța variantelor polimorfe, posibilitatea utilizării unui număr mare de soiuri pentru analiza dot-blot.
• iPBS ( inter PBS amplification ) [15]  este o metodă bazată pe utilizarea primerilor pentru secvențele de retrotranspozon PBS (primer binding site ) .  Metoda este eficientă pentru detectarea polimorfismului între probe, precum și pentru donarea de noi retrotranspozoni la eucariote . 
• Polimorfismul cu o singură nucleotidă (SNP).

Note

1. ↑ Southern EM Detectarea secvențelor specifice printre fragmente de ADN separate prin electroforeză pe gel  // J  Mol Biol : jurnal. - 1974. - Vol. 98 , nr. 3 . - P. 503-517 . - doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 .
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V., Thein SW Regiunile „minisatelite” hipervariabile în ADN-ul uman   // Natură . - 1984. - Vol. 314 . - P. 67-73 . - doi : 10.1038/314067a0 .
3. ↑ Kalendar R. Utilizarea markerilor moleculari bazați pe retrotranspozon pentru a analiza diversitatea genetică  //  Field and Vegetable Crops Research: jurnal. - 2011. - Vol. 48 , nr. 2 . - P. 261-274 . - doi : 10.5937/ratpov1102261K .
4. ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman AH Analiza diversității plantelor cu markeri moleculari bazați pe retrotranspozon  //  Heredity: journal. - 2011. - Vol. 106 . - P. 520-530 . - doi : 10.1038/hdy.2010.93 .
5. ↑ Calendar R.N., Glazko V.I. Tipuri de markeri genetici moleculari și aplicarea lor  // Fiziologia și biochimia plantelor cultivate: jurnal. - 2002. - T. 34 , nr 4 . - S. 141-156 .  (Rusă) (link indisponibil)
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV Polimorfismele ADN amplificate de primeri arbitrari sunt utili ca markeri genetici  //  Nucleic Acids Research : jurnal. - 1990. - Vol. 18 , nr. 22 . - P. 6531-6535 . doi : 10.1093 / nar/18.22.6531 .
7. ↑ Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers  //  Nucleic Acids Research : jurnal. - 1990. - Vol. 18 . - P. 7213-7218 . doi : 10.1093 / nar/18.24.7213 .
8. ↑ Sivolap Yu.M., Calendar R.N., Chebotar S.V. Polimorfismul genetic al plantelor de cereale folosind PCR cu primeri arbitrari  // Tsitol Genet. : journal. - 1994. - T. 28 . - S. 54-61 . (Rusă)
9. ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR ) -anchored polymerase chain reaction amplification   // Genomics  : journal. - Academic Press , 1994. - Vol. 20 , nr. 2 . - P. 176-183 . doi : 10.1006/ geno.1994.1151 .
10. ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., et al. AFLP: o nouă tehnică pentru amprentarea ADN-ului  // Cercetarea acizilor  nucleici : jurnal. - 1995. - Vol. 23 . - P. 4407-4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 .
11. ↑ Waugh R., McLean K., Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A., ​​​​Thomas BB, Powell W. Distribuția genetică a elementelor retrotransposabile de tip Bare-1 în genomul orzului revelată de polimorfisme de amplificare specifice secvenței (S -SAP )  (engleză)  // Molecular General Genetics: journal. - 1997. - Vol. 253 , nr. 6 . - P. 687-694 . - doi : 10.1007/s004380050372 .
12. ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman AH IRAP și REMAP: Două noi tehnici de amprentare ADN bazate pe retrotranspozon   // Genetică teoretică și aplicată : jurnal. - 1999. - Vol. 98 . - P. 704-711 . - doi : 10.1007/s001220051124 .
13. ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman AH IRAP și REMAP pentru genotiparea și amprentarea pe bază de retrotranspozon   // Nature Protocols : jurnal. - 2006. - Vol. 1 , nr. 5 . - P. 2478-2484 . - doi : 10.1038/nprot.2006.377 .
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN. Polimorfisme de inserție pe bază de retrotranspozon (RBIP) pentru analiza markerilor de mare randament  //  The Plant Journal : jurnal. - 1998. - Vol. 16 , nr. 5 . - P. 643-650 . - doi : 10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x .
15. ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman AH  iPBS : A universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation  // Genetica teoretică și aplicată : jurnal. - 2010. - Vol. 121 , nr. 8 . - P. 1419-1430 . - doi : 10.1007/s00122-010-1398-2 .