Reacția în lanț a polimerazei

Reacția în lanț a polimerazei ( PCR ) este o metodă de biologie moleculară care permite obținerea unei creșteri semnificative a concentrațiilor mici ale anumitor fragmente de acid nucleic ( ADN sau ARN ) în materialul biologic (probă).

Pe lângă amplificarea ADN-ului , PCR permite multe alte manipulări cu acizi nucleici (introducerea de mutații , splicing de fragmente de ADN) și este utilizat pe scară largă în practica biologică și medicală, de exemplu, pentru a diagnostica boli (ereditare, infecțioase), pentru a stabili paternitatea , a clona gene , a izola gene noi .

Istorie

La începutul anilor 1970, omul de știință norvegian Kjell Kleppe de la laboratorul laureatului Nobel Hara Gobinda Korana a propus o metodă de amplificare a ADN-ului folosind o pereche de molecule scurte de ADN monocatenar - primeri sintetici [1] . Cu toate acestea, la acel moment această idee a rămas nerealizată. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost inventată în 1983 de biochimistul american Kary Mullis [2] [3] . Scopul său a fost de a crea o metodă care să permită amplificarea ADN-ului în timpul dublărilor multiple consecutive ale moleculei originale de ADN folosind enzima ADN polimerază . Prima publicație despre metoda PCR a apărut în noiembrie 1985 în revista Science [4] . Metoda a revoluționat biologia moleculară și medicina. În 1993, Kary Mullis a primit Premiul Nobel pentru Chimie pentru aceasta [5] .

La începutul utilizării metodei, după fiecare ciclu de încălzire-răcire, la amestecul de reacție a trebuit să se adauge ADN polimeraza , deoarece a fost inactivată la temperatura ridicată necesară pentru separarea catenelor spiralei ADN. Procedura de reacție a fost relativ ineficientă, necesitând mult timp și enzime. În 1986, metoda reacției în lanț a polimerazei a fost îmbunătățită semnificativ. S-a propus să se utilizeze ADN polimeraze din bacterii termofile [6] . Aceste enzime s-au dovedit a fi termostabile și au fost capabile să reziste multor cicluri de reacție. Utilizarea lor a făcut posibilă simplificarea și automatizarea PCR. Una dintre primele ADN polimeraze termostabile a fost izolată din bacteriile Thermus aquaticus și numită polimeraza Taq . Dezavantajul acestei polimeraze este probabilitatea destul de mare de a introduce o nucleotidă eronată, deoarece acestei enzime îi lipsesc mecanismele de corectare a erorilor (3'→5' - activitate exonuclează ). Polimerazele Pfu și Pwo , izolate din arhee , au un astfel de mecanism; utilizarea lor reduce semnificativ numărul de mutații în ADN, dar viteza de lucru (procesivitate) este mai mică decât cea a Taq . Amestecuri de Taq și Pfu sunt acum folosite pentru a obține atât o viteză mare de polimerizare, cât și o precizie ridicată de copiere.

La momentul inventării metodei, Kary Mullis lucra ca chimist sintetic (a sintetizat oligonucleotide, care au fost folosite apoi pentru a detecta mutații punctuale prin hibridizare cu ADN genomic) la Cetus Corporation , care a brevetat metoda PCR. În 1992, Cetus a vândut drepturile asupra metodei și brevetul pentru utilizarea polimerazei Taq către Hofmann-La Roche pentru 300 de milioane de dolari. Cu toate acestea, s-a dovedit că Taq - polimeraza a fost caracterizată de biochimiștii sovietici A. Kaledin , A. Slyusarenko și S. Gorodetsky în 1980 [7] , și, de asemenea, cu 4 ani înainte de această publicație sovietică, adică în 1976, de biochimiștii americani Alice Chien, David B. Edgar și John M. Trela ​​​​[8] . Drept urmare, Promega a încercat să forțeze Roche să renunțe la drepturile sale exclusive asupra acestei enzime [9] în instanță . Brevetul american pentru metoda PCR a expirat în martie 2005.

Efectuarea PCR

Metoda se bazează pe copierea selectivă multiplă a unei anumite secțiuni de acid nucleic ADN folosind enzime în condiții artificiale ( in vitro ). În acest caz, se copiază doar zona care îndeplinește condițiile specificate și numai dacă este prezentă în eșantionul studiat. Spre deosebire de amplificarea ADN-ului în organismele vii ( replicare ), porțiuni relativ scurte de ADN sunt amplificate prin PCR . Într-un proces PCR convențional, lungimea regiunilor ADN replicate nu este mai mare de 3000 de perechi de baze (3 kbp [10] ). Cu ajutorul unui amestec de diverse polimeraze, cu utilizarea aditivilor și în anumite condiții, lungimea unui fragment PCR poate ajunge la 20-40 mii de perechi de baze. Aceasta este încă mult mai mică decât lungimea ADN-ului cromozomial al unei celule eucariote. De exemplu, lungimea celui mai scurt cromozom nuclear la om (cromozomul 21) este de 46,71 milioane de perechi de baze [11] .

Componente de reacție

Pentru PCR, în cel mai simplu caz, sunt necesare următoarele componente:

• Șablon de ADN care conține secțiunea de ADN de amplificat .
• Doi primeri care sunt complementari capetelor opuse ale diferitelor catene ale fragmentului de ADN dorit.
• ADN polimeraza termostabilă  este o enzimă care catalizează polimerizarea ADN-ului. Polimeraza pentru utilizare în PCR trebuie să rămână activă la temperatură ridicată pentru o perioadă lungă de timp, prin urmare, se folosesc enzime izolate din termofile - Thermus aquaticus ( Taq polimeraza ), Pyrococcus furiosus ( Pfu polimerază), Pyrococcus woesei ( Pwo polimerază), Thermus thermophilus ( Tth -polimeraza) și altele.
• Deoxiribo nucleozidi trifosfați (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Ioni de Mg 2+ necesari pentru ca polimeraza să funcționeze.
• Soluție tampon care asigură condițiile de reacție necesare - pH , puterea ionică a soluției . Conține săruri, albumină serică bovină .

Pentru a evita evaporarea amestecului de reacție, se adaugă în eprubetă un ulei cu punct de fierbere ridicat, cum ar fi vaselina. Dacă se folosește un ciclor cu capac încălzit, acest lucru nu este necesar.

Adăugarea de pirofosfatază poate crește randamentul PCR. Această enzimă catalizează hidroliza pirofosfatului , un produs secundar al adăugării trifosfaților nucleozidici la catena de ADN în creștere, la ortofosfat . Pirofosfatul poate inhiba PCR [12] .

Primări

Specificitatea PCR se bazează pe formarea de complexe complementare între matriță și primeri , oligonucleotide sintetice scurte lungi de 18-30 de baze. Fiecare dintre primeri este complementar unuia dintre lanțurile șablonului dublu catenar și limitează începutul și sfârșitul regiunii amplificate.

După hibridizarea matriței cu primerul (annealing [13] ), acesta din urmă servește ca primer pentru ADN polimeraza în timpul sintezei catenei complementare a șablonului (vezi mai jos ).

Cea mai importantă caracteristică a primerilor este temperatura de topire (T m ) a complexului primer-matrice.

Tm este  temperatura la care jumătate din șablonele ADN formează un complex cu primerul oligonucleotid. Formula medie pentru calcularea Tm pentru o oligonucleotidă scurtă (și pentru fragmente lungi de ADN), ținând cont de concentrația de ioni K + și DMSO :

unde  este numărul de nucleotide din primer,  este concentrația molară a ionilor de potasiu,  este suma tuturor guaninelor și citozinelor .

Dacă lungimea și compoziția nucleotidică a primerului sau temperatura de recoacere sunt alese incorect, este posibilă formarea de complexe parțial complementare cu alte regiuni ale ADN-ului șablon, ceea ce poate duce la apariția unor produse nespecifice. Limita superioară a temperaturii de topire este limitată de temperatura optimă de acțiune a polimerazei, a cărei activitate scade la temperaturi peste 80 °C.

Atunci când alegeți grunduri, este de dorit să respectați următoarele criterii:

• Compoziția GC ~ 40–60%;
• primeri T m aproape (diferențe nu mai mari de 5 °C);
• absența structurilor secundare nespecifice - ace de păr [15] și dimeri [16] ;
• guanina sau citozina sunt de dorit la capătul 3’ , deoarece formează trei legături de hidrogen cu molecula șablon, făcând hibridizarea mai stabilă.

Amplificator

PCR se efectuează într-un amplificator  - un dispozitiv care asigură răcirea și încălzirea periodică a eprubetelor, de obicei cu o precizie de cel puțin 0,1 ° C. Cicleriile moderne vă permit să setați programe complexe, inclusiv posibilitatea de „pornire la cald”, PCR Touchdown (vezi mai jos) și stocarea ulterioară a moleculelor amplificate la 4 °C. Pentru PCR în timp real, sunt produse dispozitive echipate cu un detector fluorescent . Instrumentele sunt disponibile și cu un capac automat și un compartiment pentru microplăci, permițându-le să fie integrate în sisteme automate.

Cursul reacției

De obicei, atunci când se efectuează PCR, se efectuează 20-35 de cicluri, fiecare dintre ele constând din trei etape. [≡]

Denaturare

Șablonul ADN dublu catenar este încălzit la 94-96°C (sau 98°C dacă se utilizează o polimerază deosebit de termostabilă) timp de 0,5-2 minute astfel încât lanțurile de ADN să se disperseze. Această etapă se numește topire ( denaturare ), deoarece legăturile de hidrogen dintre cele două catene de ADN sunt rupte. De obicei, înainte de primul ciclu, se efectuează o încălzire lungă a amestecului de reacție timp de 2-5 minute pentru denaturarea completă a șablonului și a primerilor.

Recoacere

Când firele sunt separate, temperatura este coborâtă pentru a permite primerilor să se lege de șablonul monocatenar. Această etapă se numește recoacere . Temperatura de recoacere depinde de compozitia primerilor si este de obicei aleasa cu 5 grade mai mica decat temperatura de topire a grundurilor. Alegerea incorectă a temperaturii de recoacere duce fie la legarea slabă a primerilor de șablon (la temperatură ridicată), fie la legarea în locul greșit și apariția unor produse nespecifice (la temperatură scăzută). Timpul etapei de recoacere - 30 de secunde Simultan, in acest timp, polimeraza are deja timp sa sintetizeze cateva sute de nucleotide. Prin urmare, se recomandă selectarea primerilor cu un punct de topire peste 60°C și efectuarea simultană de recoacere și alungire, la 60–72°C.

Alungire

ADN polimeraza replică catena matriță folosind primerul ca primer. Aceasta este etapa de alungire . Polimeraza începe sinteza celei de-a doua catene de la capătul 3’ al primerului, care sa legat de șablon, și se deplasează de-a lungul șablonului, sintetizând o nouă catenă în direcția de la capătul 5’ la capătul 3’. Temperatura de alungire depinde de polimerază. Polimerazele Taq și Pfu utilizate în mod obișnuit sunt cele mai active la 72°C. Timpul de alungire depinde atât de tipul de ADN polimerază, cât și de lungimea fragmentului de amplificat. De obicei, timpul de alungire este considerat a fi de un minut pentru fiecare mie de perechi de baze. După sfârșitul tuturor ciclurilor, este adesea efectuată o etapă suplimentară de alungire finală pentru a completa toate fragmentele monocatenare. Această etapă durează 7-10 minute.

Cantitatea unui produs de reacție specific (limitat de primeri) crește teoretic proporțional cu 2n  - 2n, unde n este numărul de cicluri de reacție [17] . De fapt, eficiența fiecărui ciclu poate fi mai mică de 100%, deci în realitate P ~ (1 + E) n , unde P este cantitatea de produs, E este randamentul mediu al ciclului.

Numărul de copii „lungi” ADN crește, de asemenea, dar liniar, astfel încât un fragment specific domină în produșii de reacție.

Creșterea produsului necesar este limitată exponențial de cantitatea de reactivi, prezența inhibitorilor și formarea de produse secundare. În ultimele cicluri ale reacției, creșterea încetinește, aceasta se numește „efectul de platou”.

Variante PCR

• RPA ( Recombinase Polymerase Amplification  - recombinase polymerase amplification ) - este utilizat în cazul în care amplificarea ADN / ARN este necesară în 15 minute fără un termociclator (reacție izotermă) [18] [19] .
• PCR imbricată  ( PCR imbricată ) - utilizată pentru a reduce numărul de produse secundare ale reacției. Utilizați două perechi de primeri și efectuați două reacții consecutive. A doua pereche de primeri amplifică regiunea ADN din produsul primei reacții.
• PCR inversă  (PCR inversă) - este utilizat dacă numai o zonă mică este cunoscută în secvența dorită. Această metodă este utilă în special atunci când este necesar să se determine secvențele învecinate după ce ADN-ul a fost inserat în genom. Pentru implementarea PCR inversată, se efectuează o serie de tăieturi de ADNcu enzime de restricțieurmate de conectarea fragmentelor (ligare). Ca rezultat, fragmentele cunoscute se află la ambele capete ale regiunii necunoscute, după care PCR poate fi efectuată ca de obicei.
• PCR cu transcripție inversă ( RT-PCR ) este utilizată pentru a amplifica, izola sau identifica o secvență cunoscută dintr-o bibliotecă de ARN. Înainte de PCR convențională, o moleculă de ADN monocatenar este sintetizată pe șablonul de ARNm folosind revertaza și se obține un ADNc monocatenar, care este utilizat ca șablon pentru PCR. Această metodă determină adesea unde și cândaceste gene sunt exprimate .
• Asymmetric PCR  (asymmetric PCR) - se efectuează atunci când este necesară amplificarea în principal a unuia dintre lanțurile ADN-ului original. Folosit în uneletehnici de analiză desecvențiereșihibridizarePCR se efectuează ca de obicei, cu excepția faptului că unul dintre primeri este luat în exces mare. O modificare a acestei metode esteLinearAfter - The - Exponential - PCR ( LATE -PCR)potrivitcu un (topire) mai mare decât primerul cu concentrație mare. PCR este efectuată la o temperatură ridicată de recoacere, menținând astfel eficiența reacției pe parcursul tuturor ciclurilor [20] .
• PCR cantitativ ( PCR cantitativ, Q-PCR ) sau PCR în timp real  ( reacție în lanț a polimerazei în timp real ), este utilizată pentru a monitoriza direct măsurarea cantității unui anumit produs PCR în fiecare ciclu de reacție. Această metodă utilizează sonde ADN marcate fluorescentpentru a analiza acumularea produsului de reacție sau a colorantului de intercalare SYBR Green (sau analogii săi). Sybr Green I oferă o opțiune simplă și rentabilă pentru detectarea și cuantificarea PCR în timp real a produselor PCR, fără a fi nevoie de sonde sau primeri fluorescente specifice. În timpul amplificării , colorantul SYBR Green I este încorporat în canalul minor al ADN-ului produselor PCR și emite un semnal fluorescent mai puternic decât colorantul nelegat atunci când este iradiat cu un laser albastru. SYBR Green I este compatibil cu toate instrumentele PCR în timp real cunoscute în prezent. Maximul de absorbție pentru SYBR Green I este la o lungime de undă de 494 nm. În plus față de cea principală, există două mici maxime suplimentare de absorbție în spectrul coloranților, la 290 nm și 380 nm. Emisia maximă pentru SYBR Green I este la 521 nm (verde) [21] .
• Stepped PCR (touchdown PCR) - folosind această abordare, influența legării nespecifice a primerilor este redusă. Primele cicluri sunt efectuate la o temperatură peste temperatura optimă de recoacere, apoi la fiecare câteva cicluri temperatura de recoacere este redusă treptat la optim. Acest lucru este pentru a se asigura că primerul hibridizează la catena complementară pe toată lungimea sa; în timp ce la temperatura optimă de recoacere, primerul hibridizează parțial cu catena complementară. Hibridizarea parțială a primerului pe ADN-ul genomic duce la amplificare nespecifică dacă există suficiente situsuri de legare pentru primer. În cele mai multe cazuri, primele zece cicluri de PCR pot fi efectuate la o temperatură de recoacere de 72-75°C și apoi imediat scăzute la optim, de exemplu, la 60-65°C.
• Metoda coloniei moleculare (PCR in gel,colony PCR) -gelul de acrilamidă este polimerizatcu toate componentele PCR de la suprafață și se efectuează PCR. În punctele care conțin ADN-ul analizat, are loc amplificarea cu formarea de colonii moleculare.
• PCR cu amplificare rapidă a capetelor ADNc (amplificare rapidă a capetelor ADNc, RACE-PCR).
• PCR de fragmente lungi ( PCR cu rază lungă ) este o modificare PCR pentru amplificarea segmentelor de ADN extinse (10 mii sau mai multe baze). Se folosește un amestec de două polimeraze, dintre care una este o polimerază Taq cu procesivitate ridicată (adică capabilă să sintetizeze un lanț lung de ADN într-o singură trecere), iar a doua este o polimerază ADN cu activitate 3'-5'-exonuclează. , de obicei Pfu polimeraza . A doua polimerază este necesară pentru a corecta erorile introduse de prima, deoarece polimeraza Taq oprește sinteza ADN-ului dacă s-a adăugat o nucleotidă necomplementară. Această nucleotidă necomplementară este îndepărtată de polimeraza Pfu . Amestecul de polimeraze este luat într-un raport de 50:1 sau chiar mai mic de 100:1, unde polimerazele Taq sunt luate de 25-100 de ori mai mult decât polimerazele Pfu .
• RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ), PCR cu amplificare aleatorie a ADN polimorf - este utilizat atunci când este necesar să se facă distincția între organisme care sunt apropiate în secvența genetică, de exemplu, diferite soiuri de plante cultivate, rase de câini sau strâns microorganisme înrudite. Această metodă utilizează de obicei un singur primer mic (aproximativ 10 pb). Acest primer va fi parțial complementar cu regiuni ale ADN aleatoare ale organismelor studiate. Prin selectarea condițiilor (lungimea primerului, compoziția primerului, temperatură etc.), este posibil să se obțină o diferență satisfăcătoare în modelul PCR pentru două organisme.
• PCR specifică grupului ( PCR specifică grupului ) - PCR pentru secvențe înrudite în cadrul aceleiași specii sau între diferite specii utilizând primeri conservatori pentru aceste secvențe. De exemplu, selecția primerilor universali pentru genele ribozomale 18S și 26S pentru amplificarea unui distanțier intergenic specific speciei: secvența genelor 18S și 26S este conservată între specii, astfel încât PCR între aceste gene va avea loc pentru toate speciile. în studiu. Opusul acestei metode este PCR unic ( PCR unic ), în care sarcina este de a selecta primeri pentru a amplifica o singură secvență din toate cele înrudite.
• PCR folosind hot start (hot start PCR) este o modificare a PCR folosind ADN polimerază, în care activitatea polimerazei este blocată la temperatura camerei de anticorpi sau molecule mici care simulează anticorpi precum Affibody , adică în momentul stabilirea reacției înainte de prima denaturare în PCR. De obicei, prima denaturare este efectuată la 95°C timp de 10 minute.
• PCR virtuală ( PCR in silico , PCR electronică, e-PCR) este o metodă matematică de analiză computerizată a unei reacții teoretice în lanț a polimerazei folosind o listă de secvențe de primer (sau sonde ADN ) pentru a prezice potențiala amplificare ADN a genomului , cromozomului , ADNc . sau orice altă regiune studiată ADN.

Dacă secvenţa de nucleotide a matriţei este parţial cunoscută sau nu este cunoscută deloc, pot fi utilizaţi primeri degeneraţi , a căror secvenţă conţine poziţii degenerate în care pot fi localizate orice baze. De exemplu, secvența primerului ar putea fi: ...ATH... unde H este A, T sau C.

Aplicarea PCR

PCR este utilizat în multe domenii pentru analiză și experimente științifice.

Criminalistica

PCR este folosită pentru a compara așa-numitele „amprente genetice”. Este nevoie de o mostră de material genetic de la locul crimei - sânge, salivă, material seminal, păr etc. Se compară cu materialul genetic al suspectului. O cantitate foarte mică de ADN este suficientă, teoretic - o copie. ADN-ul este tăiat în fragmente, apoi amplificat prin PCR. Fragmentele sunt separate folosind electroforeza ADN . Imaginea rezultată a locației benzilor ADN se numește amprentă genetică .

Stabilirea paternității

Deși „amprentele genetice” sunt unice, legăturile de familie pot fi încă stabilite prin realizarea mai multor astfel de amprente. [≡] Aceeași metodă poate fi aplicată, cu ușoare modificări, pentru a stabili relații evolutive între organisme.

Diagnosticare medicală

PCR face posibilă accelerarea semnificativă și facilitarea diagnosticului bolilor ereditare și virale . Gena dorită este amplificată prin PCR utilizând primeri adecvaţi şi apoi secvenţiată pentru a determina mutaţiile . Infecțiile virale pot fi detectate imediat după infecție, cu săptămâni sau luni (în funcție de durata perioadei de incubație ) înainte de apariția simptomelor bolii.

Medicină personalizată

Uneori, medicamentele sunt toxice sau alergene pentru unii pacienți. Motivele pentru aceasta sunt parțial în diferențele individuale în susceptibilitatea și metabolismul medicamentelor și derivaților acestora. Aceste diferențe sunt determinate la nivel genetic. De exemplu, la un pacient, un anumit citocrom (o proteină hepatică responsabilă de metabolismul substanțelor străine) poate fi mai activ, la altul - mai puțin activ. Pentru a determina ce fel de citocrom are un anumit pacient, se propune efectuarea unei analize PCR înainte de a utiliza medicamentul. Această analiză se numește genotipizare preliminară ( genotipizare prospectivă ) .

Clonarea genelor

Clonarea genelor (a nu se confunda cu clonarea organismelor) este procesul de izolare a genelor și, ca urmare a manipulărilor de inginerie genetică , obținerea unei cantități mari de produs al unei anumite gene. PCR este folosită pentru a amplifica o genă, care este apoi inserată într-un vector  , o bucată de ADN care transferă o genă străină în același organism sau în alt organism ușor de crescut. Ca vectori, de exemplu, sunt utilizate plasmide sau ADN viral. Introducerea genelor într-un organism străin este de obicei folosită pentru a obține un produs al acestei gene - ARN sau, cel mai adesea, o proteină. În acest fel, multe proteine ​​sunt obținute în cantități industriale pentru utilizare în agricultură, medicină etc.

Secvențierea ADN

În metoda de secvențiere care utilizează dideoxinucleotide marcate cu o etichetă fluorescentă sau un izotop radioactiv , PCR este o parte integrantă, deoarece în timpul polimerizării derivații de nucleotide marcate cu o etichetă fluorescentă sau radioactivă sunt inserate în lanțul de ADN. Adăugarea unei dideoxinucleotide la catena sintetizată încheie sinteza, permițând ca poziția nucleotidelor specifice să fie determinată după separarea în gel.

Mutageneză

În prezent, PCR a devenit principala metodă de efectuare a mutagenezei (introducerea unor modificări în secvența de nucleotide a ADN-ului). Utilizarea PCR a făcut posibilă simplificarea și accelerarea procedurii de mutageneză, precum și pentru a o face mai fiabilă și reproductibilă.

Sexing molecular

Un alt domeniu de aplicare practică a PCR este sexingul molecular  — determinarea sexului pe baza diferențelor de sex la nivel de ADN între bărbați și femei [22] .

Vezi și

• Amplificarea mediată de enzimele de nicking
• Amplificare dependentă de helicază
• ADN
• Imuno-PCR
• Utilizarea ADN-ului în tehnologie
• Metode de secvențiere de generație următoare
• Secvențierea
• secvențierea ARN
• Tehnologia SlipChip
• electroforeză
• electroforeza ADN
• FastPCR
• PCR în timp real

Note

1. ↑ Kleppe, K. și colab. (1971): Studii asupra polinucleotidelor. XCVI. Repararea replicărilor ADN-urilor sintetice scurte catalizate de ADN polimeraze. În: J. Mol. Biol. bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
2. ↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. O scurtă istorie a reacției în lanț a polimerazei // Protocoale PCR  (nedefinită) . — al 2-lea. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Metode în biologie moleculară). — ISBN 1-59259-384-4 . - doi : 10.1385/1-59259-384-4:3 .
3. ↑ Mullis, Kary B. și colab. „Proces pentru amplificarea, detectarea și/sau clonarea secvențelor de acid nucleic” Brevet SUA 4 683 195
4. ↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Amplificarea enzimatică a secvențelor genomice beta-globinei și analiza locului de restricție pentru diagnosticarea anemiei falciforme.
5. ^ [ Laureatii Nobel pentru Chimie 1993  ] . Preluat la 29 august 2007. Arhivat din original la 26 octombrie 2012. Laureații Nobel pentru Chimie, 1993  (engleză) ] (nedefinit)
6. ↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase Arhivat 19 decembrie 2008 la Wayback Machine . în: Știință . 239,1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
7. ↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Biochimie. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
8. ↑ Alice Chien, David B. Edgar și John M. Trela. Polimeraza acidului dezoxiribonucleic din Thermus aquaticus extrem de termofil. Jurnalul de bacteriologie, sept. 1976, pp. 1550-1557.
9. ↑ Roche anunță acordul de reglementare cu Promega (downlink) . Preluat la 29 august 2007. Arhivat din original la 6 octombrie 2008. (nedefinit) 
10. ↑ 1 kbp ( pereche de baze kilo engleză  ) - 1 mie de perechi de baze, o unitate de măsură a lungimii ADN -ului
11. ↑ Venter J, și colab. (2001). Secvența genomului uman. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
12. ↑ {titlu} (link descendent) . Consultat la 1 septembrie 2007. Arhivat din original la 29 septembrie 2007. (nedefinit) 
13. ↑ Annealing ( annealing ) - hibridizarea fragmentelor de ADN
14. ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Temperaturile de topire ale oligonucleotidelor în condiții PCR: corecții de cel mai apropiat vecin pentru concentrațiile de Mg 2+ , deoxinucleotide trifosfat și dimetil sulfoxid, în comparație cu formule empirice alternative  //  ​​Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47 , nr. 11 . - P. 1956-1961 . Arhivat din original la 1 septembrie 2012.
15. ↑ Ac de păr  - structură autocomplementară intramoleculară
16. ↑ Dimer  - structuri intermoleculare formate din primeri între ei sau cu ei înșiși
17. ↑ Calendar R. N., Sivolap Yu. M. Polymerase chain reaction with arbitrary primers  // Biopolymers and cell: journal. - 1995. - T. 11 , nr. 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (Rusă)
18. ↑ Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - amplificarea ADN/ARN izotermă care funcționează cu adevărat. . Consultat la 9 septembrie 2017. Arhivat din original pe 9 septembrie 2017. (nedefinit)
19. ↑ Video în engleză: Ce este amplificarea polimerazei recombinaze? — TwistDx Arhivat 24 noiembrie 2016 la Wayback Machine
20. ↑ Pierce KE și Wangh LJ Reacția în lanț a polimerazei liniară după exponențială și tehnologiile conexe Strategii de detectare în timp real pentru diagnosticare rapidă și fiabilă din celule unice  //  Metode Mol Med. : jurnal. - 2007. - Vol. Metode în Medicina Moleculară™ . - P. 65-85 . — ISBN 978-1-58829-578-1 . - doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . — PMID 17876077 .
21. ↑ Fluorescence SpectraViewer Fluorescence SpectraViewer | Tehnologii de viață . Data accesului: 30 octombrie 2012. Arhivat din original pe 15 noiembrie 2012. (nedefinit)
22. ↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (13.01.2001). Markeri amplificați cu reacție în lanț a polimerazei pentru sexarea păsărilor . Conferința internațională a genomului vegetal și animal a IX-a (San Diego, 13–17 ianuarie 2001) . San Diego, CA, SUA: Scherago International. p. 118.OCLC 899128222.  _ _ Rezumat P229. Arhivat din original pe 20.09.2020 . Accesat 2020-10-26 . Parametrul depreciat folosit |deadlink=( ajutor ) (Engleză)

Literatură

• Glick B., Pasternak J. Biotehnologie moleculară. Principii și aplicare. Pe. din engleza. - M .: Mir, 2002. - 589 p., ill. — ISBN 5-03-003328-9
• Patrushev L. I. Sisteme genetice artificiale. - M .: Nauka, 2005. - În 2 volume - ISBN 5-02-033278-X
• Shchelkunov S. N. Inginerie genetică. - Novosibirsk: Sib. univ. editura, 2004. - 496 p.; bolnav. — ISBN 5-94087-098-8
• Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Temperaturi de topire a oligonucleotidelor în condiții PCR: corecții de cel mai apropiat vecin pentru concentrațiile de Mg 2+ , deoxinucleotide trifosfat și dimetil sulfoxid cu comparație cu formulele empirice alternative Arhivate la 2 septembrie 2011 la Wayback Machine . Clin Chem , 47:1956-1961.
• Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Instrumente web Java pentru PCR, PCR in silico și asamblare și analiză de oligonucleotide . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Arhivat din original pe 16 septembrie 2012.

Link -uri

• Activitățile laboratorului PCR. Organizarea lucrărilor în timpul studiilor PCR a materialului infectat cu microorganisme din grupele de patogenitate I-II Copie de arhivă din 29 septembrie 2010 la Wayback Machine .
• Site-ul „Biologie clasică și moleculară”: Tehnici legate de PCR Arhivat la 8 iunie 2007 la Wayback Machine

Dicționare și enciclopedii	mare danez mare chinezesc mare chinezesc mare chinezesc Rusă mare in jurul lumii Britannica (online) Brockhaus Universalis Universalis
În cataloagele bibliografice	BNF : 121493620 GND : 4256726-9 J9U : 987007546303405171 LCCN : sh89002539 NKC : ph907888