| proteinaza K | |
|---|---|
| Notaţie | |
| UniProt | P06873 |
| Alte date | |
| Cod KF | 3.4.21.64 |
| Informații în Wikidata ? | |
Proteinaza K (proteaza K , endopeptidaza K ; EC 3.4.21.64 ) [1] este o serin protează cu spectru larg . Descoperit în 1974 într-un extract din ciuperca Engyodontium album ( Tritirachium album ) [2] .
Proteinaza K este capabilă să descompună cheratina , principala proteină din păr, de unde și numele. Principalele situsuri ale peptidei recunoscute și hidrolizate de proteinază sunt legături peptidice adiacente grupării carboxil de aminoacizi alifatici și aromatici cu o grupare alfa-amino închisă. Folosit pe scară largă datorită specificului său largi.
Proteinaza K constă din 384 de aminoacizi și conține două situsuri de legare a ionilor Ca 2+ care sunt situate în apropierea situsului activ. Activitatea enzimatică necesită prezența ionilor de Ca 2+ (1-5 mM), dar aceștia nu participă direct la reacția catalitică .
Enzima descompune proteinele în principal la aminoacizi hidrofobi (aminoacizi alifatici, aromatici și alți aminoacizi hidrofobi). Incubarea prelungită a proteinelor cu proteinază K, precum și la o concentrație mare a enzimei, duce la hidroliza lor completă . Îndepărtarea ionilor de Ca 2+ reduce stabilitatea enzimei și activitatea sa catalitică cu 80%, dar activitatea reziduală rămâne [3] ; prin urmare, proteinaza K poate fi utilizată pentru a purifica acizii nucleici din proteine în prezența EDTA .
În biologia moleculară, proteinaza K este utilizată pe scară largă pentru a îndepărta contaminanții proteici din preparatele de acid nucleic. În plus, proteinaza K scindează și inactivează rapid nucleazele din preparatele de ADN sau ARN .
Creșterea temperaturii de reacție de la 37 °C la 60 °C crește activitatea proteinazei K de câteva ori, la fel ca și adăugarea de 0,5–1% SDS sau clorură de guanidină (3 M) sau tiocianat de guanidină (1 M) sau uree (4 ). M) [4] . Deoarece disponibilitatea legăturilor peptidice ale proteinelor pentru proteinaza K crește și, astfel, chiar accelerează hidroliza acestora.
Proteinaza K funcționează într-o gamă largă de pH (4-12), optimul său este pH 8.
Temperaturile peste 65°C sau prezența acidului tricloracetic sau a inhibitorilor de serin protează AEBSF, PMSF sau DFP inhibă activitatea.
Proteinaza K nu este inhibată în prezența clorurii de guanidină (până la 3 M), tiocianat de guanidină (până la 1 M), uree (până la 4 M), Sarkosyl , Triton X-100 , Tween 20 , SDS , EDTA , citrat , acid iodoacetic și în prezența inhibitorilor de serin protează, cum ar fi Na-Tosyl-Lys Clorometil Cetona (TLCK) și Na-Tosil-Phe Clorometil Cetona (TPCK).
Activitatea proteinazei K în tampoane standard
| Tampon (pH 8,0, 50°C, 1,25 µg/mL proteinază K, incubare 15 min) | Activitatea proteinazei K (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris CI | 100 |
| 30 mM Tris CI; 30 mM EDTA; 5% Tween 20 ; 0,5% Triton X-100 ; 800 mM GuHCI | 313 |
| 36 mM Tris CI; 36 mM EDTA; 5% Tween 20 ; 0,36% Triton X-100 ; 735 mM GuHCI | 301 |
| 10 mM Tris CI; 25 mM EDTA; 100 mM NaCI; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris CI; 100 mM EDTA; 20 mM NaCI; 1% Sarcosyl | 74 |
| 10 mM Tris CI; 50 mM KCI; 1,5 mM MgCI2 ; 0,45% Tween 20 ; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris CI; 100 mM EDTA; 0,5% SDS | 120 |
| 30 mM Tris CI; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |