Sistemul de restricție-modificare este un sistem enzimatic de bacterii care distruge ADN -ul străin care a intrat în celulă . Funcția sa principală este de a proteja celula de materialul genetic străin, cum ar fi bacteriofagii și plasmidele . Componentele sistemului sunt caracterizate prin două tipuri de activitate - metiltransferaza (metilază) și endonuclează . Atât proteinele individuale, cât și o proteină care combină ambele funcții pot fi responsabile pentru fiecare dintre ele . [unu]
Sistemul de restricție-modificare (SR-M) este specific anumitor secvențe de nucleotide din ADN, numite site-uri de restricție . Dacă anumite nucleotide din secvență nu sunt metilate , endonucleaza de restricție introduce o rupere dublu-catenar în ADN (adesea cu o deplasare a mai multor nucleotide între catene), în timp ce rolul biologic al moleculei de ADN este încălcat. În cazul în care numai una dintre catenele de ADN este metilată, nu are loc nicio scindare; în schimb, metiltransferaza adaugă grupări metil la nucleotidele celei de-a doua catene. Această specificitate a SR-M permite bacteriilor să scindeze selectiv ADN-ul străin fără a-l afecta pe al lor. În mod normal, tot ADN-ul dintr-o celulă bacteriană este fie complet metilat, fie complet metilat de-a lungul unei singure catene (imediat după replicare ). În schimb, ADN-ul străin nu este metilat și suferă hidroliză. [unu]
Sistemele de restricție-modificare au fost descoperite ca urmare a studierii mecanismelor moleculare ale unui fenomen numit restricție controlată de gazdă . Esența fenomenului constă în faptul că bacteriofagii izolați din celulele unei tulpini de bacterii se înmulțesc foarte slab în alta. Când sunt infectate cu particule virale izolate din a doua tulpină, celulele primei experimentează din nou suprimarea reproducerii fagilor, în timp ce la a doua tulpină se reproduc normal. Astfel, la bacterii se observă un sistem de suprimare a reproducerii bacteriofagelor. Virușii care au reușit totuși să-l depășească devin rezistenți la acțiunea acestui sistem. S. Luria și ML Human în articolul lor din 1952 [2] au scris:
Analizând relația dintre anumiți fagi și anumiți mutanți ai bacteriilor lor gazdă, am întâlnit un nou fenomen: genotipul gazdei în care virusul se replic afectează fenotipul noilor virusuri. Modificările fenotipice inhibă capacitatea virusului de a se replica în anumite tulpini. Aceasta este o schimbare nepermanentă, un ciclu reușit de reproducere într-o gazdă adecvată readuce virusul la forma sa originală.
Text original (engleză)[ arataascunde] Analizând relația dintre anumiți fagi și anumiți mutanți ai gazdelor lor bacteriene, am întâlnit o situație nouă: genotipul gazdei în care se reproduce un virus afectează fenotipul noului virus. Modificarea fenotipică suprimă capacitatea virusului de a se reproduce la anumite gazde, dar nu și la altele. Este o schimbare tranzitorie, în sensul că un ciclu de creștere într-o gazdă potrivită readuce virusul la forma sa originală.Ulterior, s-a demonstrat că bacteriofagii izolați din tulpini diferite au același genotip, dar un model diferit de metilare a ADN-ului, corespunzător specificității CP-M a acestei tulpini. [3]
În 1978, Werner Arber , Daniel Nathans și Hamilton Smith au primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină „pentru descoperirea enzimelor de restricție și aplicarea lor la genetica moleculară”.
Enzimele CP-M sunt denumite conform sistemului propus în 1973 de Smith și Nathans . [4] Numele unei enzime începe cu un acronim de trei litere , în care prima literă este aceeași cu prima literă a numelui genului , iar restul sunt primele două litere ale speciei în care a fost găsită enzima. . Acronimul este scris cu caractere cursive. Litere suplimentare servesc pentru a desemna o anumită tulpină sau serotip . Numerele romane sunt atribuite în ordinea în care enzimele de un anumit tip se găsesc într-un anumit organism. Literele și cifrele suplimentare nu sunt scrise în cursive. De exemplu:
În sursele tipărite, există diferențe semnificative în scrierea numelor acelorași enzime (în ceea ce privește caracterele cursive și prezența spațiilor). În 2003, un grup mare de oameni de știință a propus să sistematizeze clasificarea și nomenclatura restrictazelor și metiltransferazelor. [5] În special, se propune renunțarea la utilizarea italicelor, întregul nume ar trebui să fie scris fără spații. Se recomandă evitarea denumirilor de „enzimă de restricție” și „metilază”, folosind în schimb „endonuclează de restricție” și „metiltransferază”; tipul de activitate enzimatica este indicat prin literele R (endonucleaza) si M (metiltransferaza) inaintea acronimului - M.EcoRI si R.EcoRI.
Endonucleazele de restricție introduc rupturi în ambele catene de ADN, împărțindu-l în două părți. În funcție de specificul tăierii ADN-ului, se formează produse care au structuri terminale diferite (vezi figura).
Restricția-modificare metiltransferazele adaugă grupări metil la bazele azotate ale resturilor de nucleotide ADN. Metilarea poate avea loc la pozițiile N5 și N6 în adenină , N4 și C5 în citozină . Singurul donator de grupări metil pentru ADN metiltransferaze este S-adenozină-L-metionina . În cele mai multe cazuri, numai a doua catenă de ADN semimetilat este metilat, în timp ce ADN-ul complet nemetilat este scindat datorită activității endonucleazei CP-M.
Toate CP-M necesită Mg 2+ ca cofactor. SR-M din primul și al treilea tip necesită ATP , iar al patrulea - în GTP . S-adenosilmetionina poate servi nu numai ca donator de grupări metil, ci și ca regulator alosteric.
În prezent, pe baza structurii subunității, a specificității substratului, a cerinței enzimei pentru cofactori și a naturii clivajului ADN [1] , se disting patru tipuri de sisteme de restricție-modificare. [5] [6]
CRM-urile de primul tip sunt formate din cinci subunități care funcționează ca un întreg. Subunitățile sunt desemnate prin abrevierea Hsd (determinantul specificității gazdei) și litera corespunzătoare funcției (M - ADN metiltransferaza , R - endonuclează de restricție , S - recunoașterea substratului). CP-M de primul tip este un complex de două HsdM, două HsdR și un HsdS. HsdR scindează legăturile fosfodiester din ADN și are activitate helicazică . HsdM produce metilarea reziduurilor de adenină în situsurile de restricție de la al șaselea atom de azot (m6A). HsdS asigură recunoașterea anumitor regiuni ADN, determinând specificitatea SR-M. [7]
Când acționează asupra ADN-ului nemetilat, predomină activitatea nucleazei, metilarea de novo poate fi efectuată cu o eficiență extrem de scăzută, ceea ce permite bacteriofagelor să depășească acțiunea CP-M și să dobândească capacitatea de a se multiplica într-o tulpină nouă (pentru mai multe detalii, vezi mai sus ).
Locul de restricție este o secvență asimetrică din două părți: secvența 5' a 3-5 nucleotide specifice este separată de 6-8 nucleotide de orice tip de secvența 3' specifică a 4-5 perechi de baze. După recunoașterea țintei, complexul enzimatic se deplasează de-a lungul moleculei de ADN, derulând-o ( activitate helicază ), până când întâlnește un obstacol (de exemplu, o altă proteină). Astfel, o pauză este introdusă la o distanță mare arbitrară (mii de perechi de baze) față de locul de restricție. [7] Scindarea ADN-ului CP-M tip I necesită hidroliza ATP . Acest lucru se datorează faptului că este necesară energie pentru a se mișca de-a lungul moleculei de ADN și a o desfășura după recunoașterea situsului CP-M. ATP este utilizat cu ajutorul așa-numitului. Motorul DEAD [7] este o structură conservată cu două domenii, caracteristică helicazelor și altor proteine (de exemplu, motorul molecular al Sec translocazei SecA). [opt]
Acest tip este împărțit în patru familii (IA-D) bazate pe complementare genetică, hibridizare ADN și reactivitate încrucișată imună (reactivitate încrucișată cu anticorpi ). [9]
În sistemele de restricție-modificare de acest tip, activitățile metiltransferazei și nucleazei sunt asigurate în majoritatea cazurilor de proteine independente. Endonucleazele taie ADN-ul în poziții strict definite în interiorul sau în apropierea locului de restricție, ca urmare, capetele ADN la locul de rupere au grupări 3’-hidroxil și 5’-fosfat. Datorită acestor caracteristici, endonucleazele de acest tip (în special IIP) sunt utilizate pe scară largă în inginerie genetică . SR-M II nu necesită ATP sau alte surse de energie pentru a funcționa. Nucleazele active pot exista ca monomer , homodimer sau homotetramer (pentru sisteme diferite). [5]
Metiltransferazele funcționează de obicei ca un monomer. Metilarea are loc în poziția a patra (N) sau a cincea (C) în reziduul de citozină sau la a șasea (N) - adenină (pentru sisteme diferite, fiecare enzimă individuală are specificitate strictă). [5]
Există mai multe subgrupe de tip II SR-M, unele sisteme pot aparține mai multor dintre ele simultan. [5]
Lungimea unui palindrom recunoscut este în majoritatea cazurilor de 4, 6 sau 8 nucleotide. Clivajul are loc într-o poziție fixă în interiorul sau imediat adiacent locului de restricție. În același timp, diverse enzime provoacă formarea atât a capetelor lipicioase, cât și a capetelor contondente.
SR-M de tip III includ două subunități (Res și Mod) care se combină într-un heterotetramer (Res 2 Mod 2 ) [7] cu activități de endonuclează și metiltransferază. Subunitatea Res are activitate helicazică și necesită hidroliza ATP pentru a funcționa . [6] Spre deosebire de CP-M de tip 1, hidroliza ADN-ului necesită interacțiunea a două complexe enzimatice. Ei recunosc două locuri de restricție identice în orientări opuse. Locurile pot fi nemetilate sau metilate cu o singură catenă. [7]
Subunitatea Mod poate funcționa separat de Res, acționând ca o metiltransferază (m6A). Totodată, activitatea nucleazică a subunității Res se manifestă doar atunci când este în complex cu Mod. [5]
SR-M de tip IV scindează numai ADN-ul modificat care conține baze metilate, hidroximetilate sau glicozil-hidroximetilate. Scindarea ADN-ului necesită hidroliza GTP . Activitatea endonucleazei este asigurată de o singură polipeptidă. Activitatea metiltransferazei este absentă [10] . Activitatea nucleazei este activată alosteric de S-adenosilmetionină . Locul de restricție este asimetric și este format din două părți separate. Tăierea ADN-ului are loc în apropierea unuia dintre locuri. [6] [7]