Amplificarea dependentă de helicază ( în engleză Helicase-dependent amplificatio, HDA ), de asemenea, amplificarea izotermă dependentă de helicază , este o metodă de amplificare a ADN in vitro (similară cu reacția în lanț a polimerazei ), care se efectuează la o temperatură constantă.
Reacția în lanț a polimerazei este cea mai utilizată tehnică de amplificare a ADN in vitro în scopuri de biologie moleculară și cercetare biomedicală [1] . Acest proces implică separarea ADN-ului dublu catenar la temperatură ridicată în monocatenar ( etapa de denaturare , realizată de obicei la 95-97 °C), recoacere primerilor la ADN monocatenar (etapa de recoacere) și copierea ADN-ului monocatenar pentru a crea ADN dublu catenar nou (etapa de alungire, care necesită ADN polimerază), care necesită ca reacția să fie efectuată într-un termociclator . Aceste mașini de bancă sunt mari, costisitoare și necesită costuri mari de operare și întreținere, ceea ce limitează aplicarea potențială a amplificării ADN-ului în situații din afara laboratorului (de exemplu, identificarea microorganismelor potențial periculoase la locul unei investigații sau îngrijirea pacientului). Deși PCR este asociată în mod obișnuit cu ciclul termic, originalul Mullis și colab. este dezvăluită utilizarea helicazei ca mijloc de denaturare a ADN-ului dublu catenar, care include amplificarea izotermă a acizilor nucleici . În condiții naturale, ADN-ul este replicat de ADN polimeraze cu diverse proteine accesorii, inclusiv ADN helicaze, care acționează pentru a separa ADN-ul prin desfășurarea dublului helix ADN [2] . HDA a fost dezvoltat din acest concept, folosind helicaza (o enzimă) pentru a denatura ADN-ul.
Catenele de ADN dublu catenar sunt mai întâi separate de ADN helicază și acoperite cu proteine de legare ADN-ului simplu (ssDNA). În a doua etapă, doi primeri specifici secvenței sunt hibridizați la fiecare margine a matriței ADN. ADN-polimerazele sunt apoi utilizate pentru a extinde primerii recoapți pe șabloane pentru a produce ADN dublu catenar, iar cele două produse ADN nou sintetizate sunt apoi utilizate ca substraturi de către helicazele ADN pentru a intra în următoarea rundă a reacției. Astfel, se dezvoltă o reacție în lanț simultană care duce la amplificarea exponențială a secvenței țintă alese (a se vedea Vincent și colab. , 2004 [3] pentru o schemă ).
De la publicarea descoperirii sale, tehnologia HDA a fost folosită pentru „un test de acid nucleic simplu, foarte adaptabil, pentru a detecta Clostridium difficile” [4] . Alte aplicații includ detectarea rapidă a Staphylococcus aureus prin amplificare și detectarea unei secvențe scurte de ADN specifică acestei bacterii. Avantajul HDA este că oferă o metodă rapidă pentru amplificarea unui acid nucleic țintă specific la temperatură izotermă fără a necesita utilizarea unui termociclor. Cu toate acestea, cercetătorul necesită o optimizare prealabilă a primerilor și uneori a tamponelor. De obicei, optimizarea primerilor și a tampoanelor este verificată și realizată prin PCR, ceea ce ridică problema necesității costurilor suplimentare pentru un sistem separat pentru amplificarea efectivă. Deși HDA nu necesită utilizarea unui termociclator și, prin urmare, permite cercetarea pe teren, cea mai mare parte a muncii necesare pentru identificarea microorganismelor potențial dăunătoare se desfășoară în laboratoarele de cercetare/spital. În prezent, diagnosticarea în masă a unui număr mare de probe nu poate fi încă realizată cu HDA, în timp ce reacțiile PCR efectuate într-un termociclor care găzduiește plăci de probă cu mai multe godeuri permit amplificarea și detectarea țintei ADN-ului țintă de la până la 96 de probe. Reactivii HDA sunt, de asemenea, relativ mai scumpi decât reactivii PCR, mai ales că vin ca un kit.