Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară bidimensională (2D RMN) este un tip de spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară în care datele sunt distribuite în spațiu de-a lungul a două axe. Tipurile de RMN bidimensionale includ spectroscopie de corelație (COSY), spectroscopie J, spectroscopie de schimb (EXSY) și spectroscopie nucleară Overhauser (NOESY). RMN bidimensional oferă mai multe informații despre structura unei molecule decât spectrele RMN unidimensionale și este deosebit de convenabil în stabilirea structurii unei molecule, în special a moleculelor complexe, a căror structură este dificil de stabilit folosind RMN unidimensional.
Primul experiment bidimensional, COSY, a fost propus de Jean Jeener, profesor la Universitatea Liberă Francofonă din Bruxelles în 1971 . Acest experiment a fost realizat mai târziu de Walter P. Aue, Enrico Bartholdi și Richard Ernst , care și-au publicat lucrările în 1976 . [1] [2]
Fiecare experiment constă dintr-o secvență de impulsuri de radiofrecvență ( RF ) cu perioade de întârziere între ele . Timpul, frecvența și intensitatea acestor impulsuri fac posibilă separarea experimentelor RMN unele de altele. [3] Aproape toate experimentele 2D au 4 etape:
Două măsurători ale RMN bidimensionale - două axe ale frecvențelor de deplasare chimică. Fiecare axă de frecvență este asociată cu una sau două variabile de timp - durata perioadei de evoluție ( timpul evolutiv ) și timpul scurs în timpul perioadei de detectare ( timpul de detecție ). Ambii acești timpi sunt convertiți dintr-o serie de timp într-o serie de frecvență prin intermediul unei transformări Fourier 2D . Fiecare experiment 2D este generat ca o serie de experimente 1D cu diferiți timpi de evoluție specifici într-o serie de experimente consecutive, cu durata totală a perioadei de detectare înregistrată în fiecare experiment. [patru]
Rezultatul final este o imagine care arată valorile intensității pentru fiecare pereche de frecvențe diferite. Intensitatea vârfurilor din spectru poate fi reprezentată folosind cea de-a treia dimensiune. Mai simplu spus, intensitatea este afișată prin linii de contur sau diferite culori.
În aceste metode, transferul de magnetizare are loc între nuclee de același tip prin așa-numitul. „ constantă de cuplare ” ( în engleză J-coupling ) a nucleelor conectate între ele prin mai multe legături.
Prima și cea mai populară RMN 2D este spectroscopia de corelație homonucleară (COSY), care este utilizată pentru a identifica spinurile legate între ele. Constă dintr-un singur impuls RF (p1) urmat de un timp evolutiv specific (t1) care, la rândul său, este urmat de un al doilea impuls (p2) urmat de un timp de măsurare (t2). [5]
Spectrul bidimensional obținut în experimentul COZY arată frecvențele unui singur izotop , cel mai adesea hidrogen ( 1 H), de-a lungul ambelor axe. (Tehnica experimentală a fost, de asemenea, îmbunătățită pentru a genera un spectru de corelație heteronucleară în care ambele axe corespund unor izotopi diferiți, de exemplu 13 C și 1 H). Spectrele COSY arată două tipuri de vârfuri:
Picurile diagonale corespund vârfurilor în experimentele 1D RMN (1D-NMR), în timp ce vârfurile încrucișate arată legarea între o pereche de nuclee atomice (mai mult decât separarea multipletelor arată legarea în 1D-RMN). [5]
Picurile încrucișate rezultă dintr-un fenomen numit transfer de magnetizare , iar prezența lor înseamnă că două nuclee atomice sunt legate și au două valori diferite de deplasare chimică, care dau coordonatele vârfului încrucișat. Fiecare legare produce două vârfuri transversale simetrice deasupra și dedesubtul diagonalei. Astfel, un vârf încrucișat apare atunci când există o corelație între semnalele de spectru pentru fiecare dintre cele două axe la valorile date. Prin urmare, este posibil să se determine ce atomi sunt legați unul de celălalt (în intervalul unui număr mic de legături chimice) analizând vârfurile încrucișate dintre diferite semnale. [5]
O modalitate ușoară de a determina ce fel de relație reprezintă un vârf încrucișat este de a găsi un vârf diagonal direct deasupra sau sub vârful transversal și un alt vârf diagonal imediat la stânga sau la dreapta vârfului încrucișat. Nucleele atomice reprezentate de acele două vârfuri diagonale sunt conectate între ele. [5]
În dreapta este un exemplu de spectru COZY RMN al progesteronului în DMSO-d6. Spectrul care se află de-a lungul fiecăreia dintre cele două axe este spectrul obișnuit unidimensional 1H RMN . Vârfurile sunt stivuite în diagonală, în timp ce vârfurile încrucișate sunt simetrice deasupra și dedesubtul diagonalei.
COSY-90 este cel mai comun experiment COSY. În COSY-90, pulsul p1 rotește spinul nucleului atomic cu 90°. Un alt tip de COSY este experimentul COSY-45 . În COSY-45, un impuls de 45 de grade este utilizat în loc de 90° pentru primul impuls p1. Avantajul metodei COSY-45 este că vârfurile diagonale sunt mai puțin proeminente, ceea ce face mai ușoară corelarea vârfurilor încrucișate din apropierea diagonalei pentru moleculele mari. În plus, semnele relative ale constantei de legare pot fi obținute în experimentul COSY-45. Acest lucru nu este posibil în COSY-90. [6] În general, COSY-45 oferă un spectru mai curat, în timp ce COSY-90 este mai sensibil.
Un alt tip de COSY este dublu cuantic filtrat (DQF COSY) COSY . DQF COSY folosește o metodă de selecție a coerenței, cum ar fi rotația de fază (ciclizare) sau gradientul de câmp pulsat, care declanșează semnale unice din coerența cu două cuantice pentru a da semnale observabile. Aceasta are ca efect reducerea intensității vârfurilor diagonale și schimbarea curbei acestora de la o „împrăștiere” largă la o „absorbție” clară. Îndepărtează, de asemenea, vârfurile diagonale ale nucleelor atomice nelegate. Toate acestea au avantajul de a produce un spectru curat în care vârfurile diagonale nu sunt ascunse de vârfurile încrucișate, care sunt mai palide pe un spectru COZY obișnuit. [7]
Metoda ECOSY a fost dezvoltată pentru a măsura cu precizie legăturile J mici. Utilizează un sistem de trei nuclee atomice active (sistemul de spin SXI) pentru a măsura legarea nerezolvată cu o legare mai mare care este rezolvată într-o dimensiune perpendiculară pe legarea mică.
Spectroscopia de corelație heteronucleară oferă semnale bazate pe conexiunea dintre două nuclee de două feluri diferite. Adesea, aceste nuclee sunt protoni și alte nuclee (așa-numitul „heteronucleu”, ing. heteronucleu ). Din punct de vedere istoric, experimentele care înregistrează un proton mai degrabă decât un spectru heteronuclear în momentul detectării sunt numite experimente „inverse ” . Motivul pentru aceasta este că abundența naturală scăzută a majorității heteronucleilor va face ca spectrul de protoni să fie supraîncărcat cu semnale de la molecule care nu au heteronuclei activi, astfel încât revizuirea semnalelor asociate dorite devine lipsită de sens. Odată cu apariția metodelor de suprimare a acestor semnale nedorite, experimentele de corelație „inversă” precum HSQC, HMQC și HMBC sunt cele mai frecvent utilizate astăzi. Spectroscopia de corelație heteronucleară „normală”, în care este înregistrat spectrul heteronuclear, se numește HETCOR. [opt]
HSQC definește corelațiile dintre nucleele atomice de două tipuri diferite care sunt separate printr-o singură legătură. Această metodă produce un singur vârf pentru o pereche de nuclei legați ale căror două coordonate sunt deplasările chimice ale celor doi atomi legați. [9]
HMBC determină corelații heteronucleare la distanță de până la 2-4 legături. Dificultatea în determinarea corelațiilor multi-legate este că secvențele HSQC și HMQC au o întârziere de timp specifică între impulsuri care permite doar determinarea într-o constantă de legare specifică. Aceasta nu este o problemă în metodele cu legături simple, deoarece constantele de legare sunt de obicei într-un interval îngust, dar constanta de legare multiplă acoperă intervale mult mai largi și nu poate fi capturată într-un singur experiment HSQC sau HMQC. [zece]
În HMBC, această dificultate este depășită prin neglijarea uneia dintre aceste întârzieri din secvențele HMQC. Acest lucru mărește intervalul constantelor de legare care pot fi determinate și, de asemenea, reduce pierderea semnalului de la relaxare. Cu toate acestea, acest lucru distruge posibilitatea divizării spectrului și introduce distorsiuni de fază în semnal. Există o modificare a metodei HMBC care suprimă semnalele cu o singură legătură și lasă doar semnale cu mai multe legături. [zece]
Aceste metode stabilesc corelații între nucleele care sunt apropiate fizic unul de celălalt, indiferent de locația legăturilor în molecula dintre ele. Ele se bazează pe efectul Nuclear Overhauser ( NOE ), conform căruia atomii din apropiere (la o distanță de aproximativ 5 Å) suferă o relaxare încrucișată bazată pe mecanismul relaxării spin-latice .
NOESY folosește relaxarea încrucișată nucleară Overhauser în timpul perioadei de amestecare pentru a stabili o corelație între spinurile nucleare. Spectrul rezultat este similar cu COSY, cu vârfuri diagonale și vârfuri încrucișate. Cu toate acestea, vârfurile încrucișate leagă rezonanța nucleelor care sunt apropiate spațial și nu sunt conectate între ele prin legături directe. Spectrele NOESY conțin, de asemenea , vârfuri axiale suplimentare , care nu oferă informații suplimentare și pot fi eliminate într-un alt experiment prin comutarea fazei primului impuls. [unsprezece]
Există, de asemenea, experimente 3D și 4D care se fac prin rularea frecvenței pulsului 2 sau 3 experimente 2D la rând. Cu toate acestea, multe dintre experimentele 3D efectuate în mod obișnuit sunt experimente cu triplă rezonanță ; de exemplu, HNCA și HNCOCA sunt adesea utilizate în proteina RMN .