Metoda de colorare Ziehl-Nielsen (conform Ziehl-Nelsen [1] ) este o metodă de colorare a microorganismelor pentru a detecta micobacteriile rezistente la acid (agenți cauzatori ai tuberculozei , micobacteriozei , lepră ), actinomicetelor și altor microorganisme rezistente la acid . Rezistența la acid a microorganismelor se datorează prezenței lipidelor , ceară și hidroxiacizilor în celulele acestora . Astfel de microorganisme se colorează slab cu soluții de coloranți diluate. Pentru a facilita pătrunderea colorantului în celulele microorganismelor, fuchsinul carbolic al lui Ziehl a fost aplicat preparatului. încălzit peste flacăra unui arzător. Microorganismele colorate nu sunt decolorate de soluții slabe de acizi minerali și alcool.
Metoda este numită după medicii germani - microbiologul Franz Ziel și patologul Friedrich Nelsen ( Nielsen), care au dezvoltat-o în 1882-1883 .
se dizolvă 0,3 g de clorură de albastru de metilen în 100 ml apă distilată.
Când sunt colorate prin această metodă, bacteriile rezistente la acid devin intens roșii , restul microflorei se colorează în albastru deschis [3] .
Mycobacterium tuberculosis rezistent la acid are aproximativ 1-10 microni lungime și 0,2-0,6 microni lățime. De obicei, acestea sunt văzute sub formă de bețișoare subțiri grațioase, dar uneori puteți găsi opțiuni curbate sau răsucite. Când este colorat cu fuchsin carbolic , Mycobacterium tuberculosis este detectat ca tije subțiri, ușor curbate, roșu-zmeură, care conțin un număr variabil de granule. Microorganismele, situate singure, în perechi sau în grupuri, se evidențiază bine pe fundalul albastru al altor componente ale medicamentului. Nu este neobișnuit ca celulele bacteriene să formeze un număr roman „V”.
În interiorul celulelor microbiene individuale, pot fi găsite zone cu colorare mai intensă, ceea ce are ca rezultat un aspect „beading”, în timp ce zonele mai slabe colorate pot fi văzute ca „drîuri”. În preparat, pot fi detectate, de asemenea, forme rezistente la acid asemănătoare cocilor modificate ale agentului patogen, structuri sferice rotunjite sau asemănătoare miceliului. Cu toate acestea, în cazul detectării formelor modificate de microorganisme rezistente la acid, un răspuns pozitiv trebuie confirmat prin metode suplimentare de cercetare.
Unele alte microorganisme, care nu au legătură cu M.tuberculosis , pot avea diferite forme - de la bastoane lungi la forme cocoide cu intensitate variabilă a colorării. Grade variate de colorare acido-rezistentă pot fi observate nu numai la micobacterii, ci și la alte microorganisme. Acestea pot fi Rhodococcus , Nocardia, Legionella , precum și Chisturile Cryptosporidium și Isospora . Micobacteriile cu creștere rapidă pot diferi în ceea ce privește gradul de culoare acid-rezistentă - cu o pierdere parțială a culorii acid-rezistente, ele capătă o culoare violet-purpuriu.
Într-un studiu cultural, răspunsul despre izolarea micobacteriilor acido-rezistente este dat numai după microscopia unui frotiu colorat cu Ziehl-Neelsen din colonii crescute. La pregătirea frotiurilor pentru examinarea microscopică, coloniile de Mycobacterium tuberculosis își arată caracteristicile fizice și chimice: nu se emulsionează într-o soluție izotonă, ci formează o suspensie granulară, sfărâmicioasă. Acest lucru se datorează prezenței în compoziția peretelui lor celular a unui număr mare de substanțe hidrofobe de ceară grasă. Examinarea microscopică a frotiurilor din coloniile crescute, colorate conform lui Ziehl-Nelsen, dezvăluie bacterii strălucitoare în formă de tijă roșu purpuriu, situate singure sau în grupuri, formând ciorchini sau țesături sub formă de „pâslă” sau „împletituri”. Micobacteriile tuberculoase arată ca niște bețișoare subțiri, drepte sau ușor curbate, de 1–10 (de obicei 1–4) µm lungime, 0,2–0,6 µm lățime, omogene sau granulare cu capete ușor rotunjite. Mai des în preparare, în special în culturile cu creștere lungă, sunt vizibile acumulări de boabe de culoare închisă. In culturile tinere, izolate mai ales de la pacientii tratati timp indelungat cu medicamente antituberculoase, micobacteriile se caracterizeaza prin polimorfism ridicat, pana la aparitia unor forme scurte, aproape cocoide.
Examinarea microscopică a unui frotiu ar trebui să examineze cel puțin 100 de câmpuri vizuale pentru a cuantifica medicamentul și a detecta o singură micobacterie. În cazul în care rezultatul unui astfel de studiu se dovedește a fi negativ, alte 200 de câmpuri vizuale sunt vizualizate pentru confirmare. Cu un număr semnificativ de micobacterii rezistente la acid, este suficient să examinăm 20-50 de câmpuri vizuale atât cu colorație Ziehl-Neelsen, cât și cu microscopie fluorescentă (vezi tabelul ). În timpul examinării microscopice a preparatului, este necesar să vă asigurați că niciun câmp vizual al preparatului nu este vizualizat în mod repetat, prin urmare se recomandă să vizualizați preparatul întotdeauna conform aceleiași scheme:
Ei încep să vadă preparatul din câmpul vizual din stânga sus selectat în frotiu, deplasându-se treptat fie de-a lungul axei longitudinale a preparatului până la sfârșitul frotiului, fie deplasându-se în jos și apoi ridicându-se din nou etc., trecând prin toate câmpuri vizuale până la marginea frotiului. Cu o mărire a microscopului de 1000x, adică 100x pentru un obiectiv cu imersie în ulei și 10x pentru un ocular, la examinarea unei lungimi de cursă (~ 20 mm), aproximativ 100-120 de câmpuri vizuale sunt vizualizate într-o singură trecere longitudinală (diametrul câmpului). - 0,16 - 0, 2 mm).
| Rezultatul cercetării | Număr minim de câmpuri vizuale (p/s) | Formularul de înregistrare a rezultatelor | Interpretarea rezultatelor studiului |
|---|---|---|---|
| AFB [4] nu este detectat în 300 p/s | 300 | OTR. | Negativ |
| 1 - 2 KUM în 300 p / s | 300 | Se recomandă repetarea studiului | Rezultatul nu este evaluat |
| 1 - 9 KUM în 100 p / s | 100 | „_N__” KUM în 100 p/s [5] | Pozitiv |
| 10 - 99 KUM în 100 p / s | 100 | 1+ [6] | Pozitiv |
| 1 - 10 KUM în 1 p / s | cincizeci | 2+ [6] | Pozitiv |
| Mai mult de 10 KUM în 1 p/s | douăzeci | 3+ [6] | Pozitiv |