Poziționarea nucleozomilor este determinarea poziției nucleozomilor pe secvențele de ADN eucariote . Segmentele de ADN pot fi fie parte din complexe nucleozomale, fie parte din linker, ADN internucleozomal. Această caracteristică a ADN-ului determină disponibilitatea acestuia pentru interacțiunea cu proteinele .
Dezvoltarea metodelor de poziționare a nucleozomilor datează din 1973, când s-a demonstrat că proprietatea cromatinei nucleare , sub acțiunea nucleazelor endogene, se împarte într-o serie de fragmente individuale de ADN de lungime aproximativ egală. Inițial, în experimente, deoxiribonucleaza I a fost folosită ca nuclează; ulterior, nucleaza micrococică a devenit larg răspândită [1] .
O metodă experimentală pentru determinarea regiunilor ADN care alcătuiesc nucleozomii se bazează pe utilizarea nucleazei micrococice (metoda MNase-seq). Celulele sunt înghețate și zdrobite, lăsate să se dezghețe. După decongelare, omogenatul care conține cromatină este tratat cu nuclează micrococică. Nucleaza scindează regiunile linker ale ADN-ului care nu sunt protejate de nucleozomi. Cu ajutorul proteazelor și RNazelor , soluția este purificată din proteine și ARN . Din soluție se extrage ADN-ul. Se folosește atât cromatografia pe coloană, cât și opțiunile de extracție lichidă - extracție cu fenol-cloroform [2] .
ADN-ul este precipitat cu etanol . Nu toate site-urile linker au putut fi scindate de nuclează. În această etapă, produsul ADN constă dintr-un amestec de fragmente de ADN corespunzătoare regiunilor cu acoperire nucleozomală diferită. Fragmentele de ADN sunt separate după mărime prin electroforeză pe gel de agaroză . ADN-ul este extras din banda de gel care conține produsul mononucleozom. Fragmentele de ADN rezultate sunt pregătite pentru secvențiere . Utilizarea tehnologiei SOLiD extrem de eficientă este larg răspândită . Ca rezultat al secvențierii, se obține o bibliotecă de fragmente de ADN Fragmentele sunt mapate la genom . Acoperirea diferitelor părți ale genomului este utilizată pentru a judeca locația nucleozomilor în funcție de secvența ADN [3] [4] .
Utilizarea nucleazei micrococice se datorează faptului că are atât activități endonucleaze , cât și exonucleaze . Nucleaza taie ADN-ul și scindează secvenţial nucleotidele de la capetele libere. Dezavantajul nucleazei micrococice este preferința sa, ca endonuclează, pentru situsurile compuse din nucleotide alternante dA și dT după dC sau dG . În același timp, recunoaște slab site-urile doar din dA sau dT repetate (4-6). Ca exonuclează, nucleaza micrococică scindează nucleotidele dC și dG mai lent. Activitatea enzimei este puternic inhibată în regiunile ADN-ului care interacționează cu proteinele. Cu un timp lung de expunere, nucleaza începe să scindeze și ADN-ul nucleozomal, în principal în locuri apropiate de suprafața nucleozomului. Lucrarea enzimei în experiment este oprită prin adăugarea unei soluții de EDTA [5] .
Metoda MNase-seq poate fi completată de perturbarea ultrasonică și/sau imunoprecipitarea histonei H3 (ChIP-seq), precum și utilizarea de enzime precum DNază (DNase-seq), transpozaza (ATAC-seq) și CpG [ -metiltransferaza (NOME-seq). Distrugerea chimică directă a ADN-ului între nucleozomi poate fi utilizată, de exemplu, folosind un radical hidroxil sau molecule aromatice mici precum metidiu propil-EDTA, care este introdus în dubla helix ADN în principal în regiunile dintre nucleozomi și îl distruge în prezența cationilor Fe 2+ (metoda MRE -seq) [6] .
Când se studiază diverși factori care influențează distribuția nucleozomilor peste ADN, se încearcă de obicei izolarea componentei de influență a secvenței de nucleotide în sine. Pentru a face acest lucru, complexul de ADN cu proteine histone este asamblat in vitro din ADN și octameri de histonă purificați anterior din proteine . Cantitățile de ADN și histone sunt luate într-un anumit raport, aproximativ un octamer de histonă la 850 de perechi de baze . În continuare, se efectuează aceleași manipulări ca în metoda obișnuită folosind nucleaza micrococică [3] .
În prezent, metode de poziționare a nucleozomilor sunt dezvoltate folosind metode bioinformatice . La baza metodelor se află regularitățile dezvăluite experimental în distribuția nucleozomilor în diferite regiuni ale genomului și dependența acestor distribuții de secvența nucleotidelor ADN [7] . Datele privind rezultatele cartografierii experimentale a nucleozomilor sunt colectate în baza de date NPRD ( Eng. Nucleosome Positioning Region Database ) [8] .