Microelectrod de sticlă

Un microelectrod de sticlă este o pipetă de  sticlă foarte subțire umplută cu un electrolit . Folosit în electrofiziologie . Dezvoltarea metodelor cu microelectrozi a făcut posibilă efectuarea de studii electrofiziologice la nivelul celulelor individuale.

Diametrul vârfului unui microelectrod de sticlă este de aproximativ 0,5 µm, uneori mai mic de 0,1 µm [1] ; atunci când este privit printr- un microscop optic , poate fi imposibil de distins.

Acest instrument nu trebuie confundat cu modelele subțiri de electrozi ionometrici din sticlă , în special cu cele utilizate și în electrofiziologie.

Aplicație

Există trei moduri principale de a utiliza microelectrozii:

O dezvoltare ulterioară a tehnologiei microelectrodului a fost metoda de fixare locală a potențialului ( metoda patch clamp ) [2] . Tipurile speciale de microelectrozi dezvoltați pentru această metodă sunt denumite în mod obișnuit micropipete . Sensibilitatea metodei face posibilă înregistrarea activității canalelor ionice individuale ale membranei celulare.

Istorie

Înainte de dezvoltarea microelectrodilor de sticlă în fiziologie, electrozi metalici au fost utilizați, de exemplu, din sârmă de tungsten măcinată electrochimic [3] . Rezistența electrică scăzută a electrozilor metalici a făcut posibilă utilizarea echipamentelor de înregistrare primitive cu o rezistență scăzută de intrare cu aceștia. În unele zone, astfel de electrozi sunt încă utilizați astăzi.

Microelectrozii de sticlă au fost utilizați pentru prima dată în 1949 [4] de G. Ling și R. V. Gerard în munca lor privind înregistrarea potențialului de membrană al miocitelor de broaște .

V. L. Nastuk și A. L. Khodzhkin în 1950, folosind [5] tehnica microelectrodului, au înregistrat potențialul de acțiune al unei fibre musculare.

Utilizarea microelectrozilor de sticlă pentru aplicarea substanțelor pe membrana celulară a fost sugerată de VL Nastuk în 1953 [6] .

În URSS, tehnica microelectrodului a fost pusă în practică de Platon Grigoryevich Kostyuk [7] . La Facultatea de Biologie a Universității de Stat din Moscova, G. A. Kurella a folosit în lucrarea sa atât tehnica microelectrodului, cât și electrozi ionometrici din sticlă miniaturali pentru studiul structurilor subcelulare.[ clarifica ] [8] .

Proiectare și fabricare

Materialul pentru fabricarea microelectrodului este un capilar de sticlă cu un diametru de aproximativ 1 mm. De obicei, folosesc marca de sticlă „ Pyrex ”, mai rar folosesc alte tipuri de sticlă - aluminosilicat 38-ЗС și sticlă de cuarț. Adesea, un capilar cu filamente de sticlă topite în el este luat ca semifabricate - în acest caz, umplerea microelectrodului cu electrolit este facilitată în viitor. Blankurile sunt curățate temeinic.

Pregătirea micropipetei

Un microelectrod de sticlă este realizat prin întinderea și ruperea unui capilar încălzit pe un dispozitiv special - un extractor (microforge). Parametrii microelectrodului rezultat depind de tipul de sticlă selectat, diametrul capilarului, temperatura de încălzire, momentul începerii smuciturii și rezistența acestuia. [1] Cele mai avansate modele de extractoare moderne controlate de microprocesor fac posibilă programarea diferitelor forme ale vârfului unei micropipete retractabile [9] , oferind proprietăți predeterminate și o bună repetabilitate.

Partea cilindrică a piesei rezultate se îngustează treptat, transformându-se în partea de perforare. Micropipetele alungite sunt examinate la microscop; cu diametrul vârfului de străpungere mai mic de 0,5 μm, nu se distinge, pierzându-se în franja de interferență. În unele cazuri, vârful microelectrodului este suplimentar ascuțit sau topit într-un mod special.

Microelectrozii pentru clemele de plasture sunt acoperiți suplimentar cu silicon pentru a asigura formarea unui contact gigaohm atunci când membrana celulară este atinsă.

Umplerea electrodului

Piesa de prelucrat este umplută cu un electrolit, cel mai adesea cu o soluție 2-3 M de clorură de potasiu. Uneori se folosesc electroliți cu o compoziție diferită sau electrodul este umplut cu un metal cu punct de topire scăzut, de exemplu, aliajul de lemn [10] .

Umplerea electrozilor poate fi dificilă din cauza diametrului foarte mic al părții sale de lucru. Pentru a o facilita, au fost propuse o serie de tehnici: umplerea în vid, pre-umplerea cu alcool și apoi înlocuirea alcoolului cu un electrolit [11] . În prezent, metoda propusă de Tasaki [12] folosind o fibră de sticlă topită într-o micropipetă este utilizată pe scară largă, în timp ce microelectrodul este umplut sub acțiunea forțelor capilare [13] .

Conexiune și control

Pentru a conecta electrozii la echipamentul de măsurare, aceștia sunt fixați într-un suport umplut cu electrolit sau un fir de argint clorurat este introdus în partea cilindrică a electrodului umplut .

Calitatea microelectrodului umplut și conectat este controlată prin măsurarea rezistenței acestuia, care are ordinul unităților de megaohm. O rezistență mai mică indică faptul că vârful microelectrodului este rupt, o rezistență mai mare sau care se schimbă haotic indică faptul că vârful de perforare este înfundat cu murdărie.

Microelectrozii finiți sunt stocați prost, așa că de obicei sunt fabricați imediat înainte de începerea experimentului [14] . De ceva timp, nu mai mult de o zi, pot fi păstrate la frigider, scufundate într-un pahar cu electrolit. În timpul depozitării pe termen lung, electrozii își pierd utilitatea din cauza cristalizării electrolitului, fiind posibil să-i supraîncărșească cu colonii de microorganisme [15] .

Proprietățile fizice și chimice ale microelectrodului

Între microelectrod și mediul în care este scufundat au loc diverse procese fizico-chimice (soluție fiziologică, conținut celular).

Proprietățile electrice ale microelectrodului

Rezistența electrică  este cel mai important parametru al unui microelectrod. Rezistența trebuie controlată înainte de începerea experimentului și, în unele cazuri, chiar în timpul lucrului. Pentru un electrod valid, rezistența este între 5 și 20 MΩ. Rezistența mai mică de 1 MΩ este un semn al unei piese perforante sparte, mai mult de 60 MΩ - vârful electrodului este prea subțire sau înfundat cu cristale precipitate sau particule ale obiectului studiat [17] . Schimbarea aleatorie a rezistenței este, de asemenea, caracteristică unui electrod contaminat [14] . Electrozii cu rezistență mare au zgomot intrinsec mare și sensibilitate la interferența electromagnetică. La curenți care depășesc 1 nA, caracteristicile curent-tensiune ale microelectrodului pot deveni neliniare. Calculul rezistenței electrozilor este posibil, dar este complicat și nu oferă o precizie ridicată, prin urmare, în practică, rezistența electrodului este determinată experimental [18] .

capacitatea electrodului . Prezența unui microelectrod cu propria sa capacitate distorsionează forma semnalului înregistrat. Prin urmare, se fac eforturi pentru a o reduce și compensa: crește diametrul părții cilindrice a electrodului, reduce lungimea acestuia, încearcă să folosești cele mai scurte fire posibile pentru a te conecta la amplificator. Pentru a compensa capacitatea electrodului în treapta de intrare a amplificatorului , se utilizează feedback negativ capacitiv . Compensarea capacității este controlată prin aplicarea unui semnal dreptunghiular la electrod  - cu setarea corectă, forma frontului acestuia nu este distorsionată [19] .

Potenţial de deplasare . Apare din mai multe motive. Principalele sunt:

Potențialul de polarizare al electrodului conectat la amplificator și scufundat în soluție salină este compensat prin reglarea amplificatorului.

Pentru a reduce auto-potențialul nedorit, se folosesc și următoarele metode [21] :

Tipuri de microelectrozi

Microelectrozi multicanal

Microelectrozii multicanal sunt adesea folosiți în studiile care utilizează iontoforeză (microelectroforeză). Ele permit înregistrarea simultană a activității electrice și introducerea de substanțe active din arborele de micropipete adiacente. De obicei, numărul de canale ale unui astfel de electrod complex este de cel puțin trei: unul servește pentru înregistrare, al doilea pentru compensarea și controlul efectelor curente, iar al treilea pentru introducerea substanței de testat [22] .

Canalele individuale pot fi dispuse paralel unul cu celălalt sau coaxial.

Capacitatea mare parazita a microelectrodilor multicanal este uneori compensata prin crearea unui ecran conductiv prin pulverizarea metalului sau a grafitului pe partea sa nefunctionala [22] .

Centrifugarea poate fi utilizată pentru a umple microelectrozii multicanal cu electrolit și soluții de substanțe de testat .

Pregătirea microelectrodilor multicanal este dificilă din punct de vedere tehnic; s-a susținut că fabricarea lor este atât de mult o artă, cât și o știință [23] .

Microelectrozi compoziți

Sunt folosite în aceleași scopuri ca și cele multicanal. Microelectrozii compoziți rănesc celula mai puternic, cu toate acestea, caracteristicile lor electrice le depășesc adesea pe cele multicanal. Colectat de la microelectrozi separați, controlând lucrul la microscop [22] .

Microelectrod plutitor

Microelectrozii plutitori propuși de Woodbury și Brady [24] sunt utilizați pentru a înregistra activitatea electrică a celulelor din țesuturile contractile, de exemplu, miocardul . Au un design ușor, cu o parte cilindrică foarte scurtă și sunt fixate pe o sârmă subțire de argint sau wolfram cu o picătură de lac. Cu un micromanipulator, electrodul este adus la suprafața țesutului și coborât pe acesta. Se injectează în țesut sub influența propriei greutăți; când electrodul intră în celulă, se observă un salt de tensiune.

Datorită elasticității firului, electrodul se poate mișca împreună cu țesutul în care este introdus. În practică, este posibil să păstrați electrodul în celulă timp de câteva minute. .

Micropipete pentru cleme de plasture

Amplificatoare pentru lucrul cu microelectrozi de sticlă

Amplificatoarele de biopotențial utilizate cu microelectrozi de sticlă ar trebui să aibă următoarele caracteristici [25] :

Pentru a lucra cu metoda patch clamp , se folosesc amplificatoare specializate.

Vezi și

Note

  1. ↑ 1 2 Kamkin, 2011 , p. 26.
  2. ↑ Hamill OP, Marty F., Neher E. et al. Tehnici îmbunătățite de patch-clamp pentru înregistrarea curentului de înaltă rezoluție din plasturi de membrană fără celule și cekk // Europ. J Physiok. - 1981. - Vol. 391(2) p.85-100.
  3. ↑ Kojeckin, 1975 , p. 63.
  4. ↑ 1949, G. Ling & RW Gerard, The normal membrane potential of frog sartorius fibres, în: J. Cell. Comp. Fiziol., 34, p. 383-96.
  5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). „Activitatea electrică a fibrelor musculare individuale”. J. Cell. Comp. fiziol. 35:39-73
  6. ↑ Nastuk WL Activitatea electrică a membranei celulare musculare la joncțiunea neuro-musculară - J. Cellular Comp. fiziol. — v. 42, p.249-272, 1953
  7. ↑ Kostyuk Platon Grigorievici // Marea Enciclopedie Sovietică  : [în 30 de volume]  / cap. ed. A. M. Prohorov . - Ed. a 3-a. - M .  : Enciclopedia Sovietică, 1969-1978.
  8. ↑ Despre studiile lui G. A. Kurella și Litvin F. F. - Kondrashin A. A., Samuilov V. D. Soare - energie - viață. // Teoria evoluției așa cum este arhivată 19 iulie 2011 la Wayback Machine .
  9. ↑ [1] Arhivat pe 13 februarie 2018 la Wayback Machine Warner Instruments PMP-102 este un extractor controlat de microprocesor.
  10. ↑ Shanes AM  - Electrochemical Aspects of Physiological and Pharmacological Action in Excitable Cells - Pharmacol. Rev., v.10, p.59-164, 1958
  11. ↑ Goffman B., Cranefield P. Electrophysiology of the heart. — Traducere din engleză. Tsuzmer E. S. ed. Babsky E. B. - M .: Editura de literatură străină - 1962
  12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner MJ, Yu WY O metodă simplă, directă și rapidă de umplere a microelectrozilor. — Fiziol. Comportament, 1968, v.3, p. 1009-1010.
  13. ↑ Kamkin, 2007 .
  14. ↑ 1 2 Atelier mare de fiziologie: manual. indemnizație pentru studenți. superior manual instituţii / A. G. Kamkin şi alţii.M.: Izd. Centrul „Academiei” 2007.
  15. ↑ Kojeckin, 1975 , p. 82.
  16. ↑ Kamkin, 1989 , p. 108.
  17. ↑ Kamkin, 2011 , p. 32.
  18. ↑ Kamkin, 1989 , p. 112.
  19. ↑ Kamkin, 2011 , p. 33.
  20. ↑ Kamkin, 2011 , p. 34.
  21. ↑ Kojeckin, 1975 , p. 76.
  22. ↑ 1 2 3 Alexandrov A. A. Metoda microelectroforezei în fiziologie. - L .: Nauka, 1983. - 148 p. — (Metode de cercetare fiziologică).
  23. ^ Kelly JS Aplicarea microiontoforetică a medicamentelor pe neuroni unici. - În: Manual de psihofarvacologie. New York; Londra, 1975, v.2, p. 29-67
  24. ↑ Woodbury JW, Brady AJ Înregistrare intracelulară din țesuturi în mișcare cu un microelectrod montat flexibil - Știință, 123, p. 100-101, 1956
  25. ↑ Kamkin, 2011 , p. 43.

Note

  1. ↑ Cu unele simplificări, viteza de difuzie (mol/s) poate fi estimată astfel: , unde  este concentrația de electrolit,  este coeficientul de difuzie,  este jumătate din unghiul intern al vârfului electrodului, constantă pentru acest tip de electrod,  este raza interioară a vârfului de perforare. Adică, viteza de difuzie este direct proporțională cu grosimea vârfului de perforare și cu concentrația electrolitului de umplere a microelectrodului.

Literatură