Metoda de fixare a potențialului local , patch-clamp ( ing. patch - fragment, clamp here - fixation ) este o tehnică electrofiziologică de studiere a proprietăților canalelor ionice , constând în faptul că un fragment al membranei celulare este izolat cu ajutorul unui micropipetă. Această tehnică permite experimentatorului să controleze diferența de potențial dintre părțile laterale ale membranei, precum și să o plaseze într-un mediu cu o anumită compoziție chimică. În aceste condiții bine controlate, curenții de ioni care trec prin membrană sunt măsurați, ceea ce duce în cele din urmă la concluzii despre modul în care canalele ionice răspund la stimularea electrică și chimică. Metoda este atât de sensibilă încât permite observarea comportamentului și transformărilor chimice ale moleculelor individuale care interacționează cu membrana. [1] Au fost dezvoltate protocoale experimentale pentru a măsura caracteristicile canalelor ionice într-un mod optim. Cercetătorii germani Erwin Neher și Bert Sakmann , care au dezvoltat această tehnică, au primit Premiul Nobel în 1991.
Celulele vii sunt acoperite cu o membrană , a cărei bază structurală este un strat dublu de lipide , ușor permeabil la apă și practic impermeabil la ioni. Fiecare celulă trebuie să facă schimb cu mediul extern diverse substanțe și, în special, ioni. Transportul ionilor prin membrană joacă un rol important în procesele de excitație celulară și transmitere a semnalului. Ionii intră în celulă și o părăsesc prin structurile proteice construite în membrană - canale și transportori [2]
Transportatorii sunt proteine de membrană care se leagă de o substanță transportată pe o parte a membranei, transportă această substanță peste membrană și apoi o eliberează. Un astfel de transfer devine posibil deoarece, ca urmare a conexiunii cu o substanță, transportorul își schimbă conformația (adică forma, orientarea). Cel mai important transportator din celulele eucariote este pompa de sodiu-potasiu . Pentru ca această pompă să funcționeze, este nevoie de energie, pe care o extrage din ATP -ul stocat în celulă . În timpul unui ciclu de funcționare, pompa elimină 3 ioni Na + din celulă și introduce 2 ioni K + în ea . O moleculă a acestui transportor face aproximativ 10³ cicluri pe secundă. O frecvență similară a ciclurilor este tipică pentru alte tipuri de transportoare [3] .
Canalele sunt proteine care funcționează ca pori membranari, deoarece formează deschideri prin care pot trece ionii. Canalele de membrană sunt selective - permeabile numai pentru anumite substanțe. Selectivitatea se datorează razei porilor și distribuției grupelor funcționale încărcate în ei. Există canale care trec selectiv ionii de sodiu (canale de sodiu), precum și canalele de potasiu, calciu și clorură. Pentru fiecare tip de ion, nu există unul, ci destul de multe tipuri de canale [4] . 10 6 - 10 7 ioni trec printr-un canal pe secundă [3] .
În ciuda diferențelor fundamentale în mecanismul de transport prin canale și transportatori, aceștia pot fi formați din proteine foarte omoloage. Deci, date primite recent că mutația unui singur aminoacid în proteina transportorului de metal divalent DMT1 duce la transformarea acestuia într-un canal de calciu . În plus, există cel puțin un transportor (un schimbător eritrocitar clorură-bicarbonat) care efectuează 10 5 transferuri pe secundă [3] , ceea ce este foarte apropiat de vitezele caracteristice canalelor și sugerează existența unor „intermediare” între canalele și mecanismele transportoare.
Deoarece ionii sunt molecule încărcate electric, atunci când trec prin canalele membranei, sarcina este de asemenea transferată, ceea ce înseamnă că un curent electric trece prin membrană. Acest curent poate fi măsurat. Cu cât diferența de potențial dintre laturile membranei este mai mare, cu atât este mai mare curentul. Conductibilitatea (raportul dintre curent și diferența de potențial) a unui singur canal în stare deschisă variază în funcție de tipul de canal, de la 4–5 (în CFTR [5] și ENaC [6] ) la 30–50 (de exemplu, în un receptor colinergic sensibil la nicotină [7 ] ) picosiemens . Aceasta înseamnă că, cu o diferență de potențial de 100 mV, un curent de câțiva picoamperi va curge prin canal.
Fenomenele electrice de pe membranele celulare pot fi măsurate folosind microelectrozi de sticlă ascuțiți care sunt introduși în celulă. Tehnica cu un electrod intracelular permite măsurarea diferenței de potențial la un curent fix. Mai rar, această tehnică poate măsura curentul la un potențial fix utilizând tehnica clemei de comutare. Toate măsurătorile au loc exclusiv pe întreaga celulă, studiind astfel proprietățile electrice ale întregii membrane celulare.
Faptul că fixarea potențialului transmembranar va face posibilă măsurarea conductivității membranei din modificările curentului la o tensiune constantă a fost recunoscut pentru prima dată în anii 1940. XX, iar în curând cercetătorii englezi Alan Hodgkin și Andrew Huxley ( Alan Hodgkin și Andrew Huxley ) au început experimente cu clemă de potențial cu doi electrozi (clemă de tensiune cu 2 electrozi). [8] Esența metodei este următoarea. Doi electrozi sunt introduși în celulă, încă unul - electrodul de referință - rămâne în afara celulei. Primul electrod intracelular servește la măsurarea diferenței de potențial transmembranar (adică diferența de potențial dintre acesta și electrodul de referință), al doilea poate furniza curent. Nu este posibil să se folosească același electrod ascuțit pentru alimentarea cu curent și măsurarea diferenței de potențial. Faptul este că un astfel de electrod are o rezistență electrică de intrare de ordinul 100-200 MΩ, care este comparabilă cu rezistența membranei celulei, prin urmare, dacă curentul trece prin sistemul „electrod-celula”, atunci scăderea de tensiune. pe electrod va fi proporțională cu căderea de tensiune pe membrana însăși și nu există nicio modalitate de a separa aceste două părți [8] . În plus, un dispozitiv special - un generator de semnal - setează potențialul de comandă , care ar trebui să fie egal cu potențialul transmembranar. Potențialul transmembranar măsurat este alimentat la intrarea dispozitivului de comparare , care scade potențialul măsurat din cel de comandă și, în funcție de mărimea diferenței, furnizează curent electrodului de curent în așa fel încât să compenseze această diferență. Monitorul de curent , la rândul său, măsoară constant cantitatea de curent necesară pentru aceasta. În anii 1940 și 50, când Hodgkin și Huxley lucrau, nu existau microelectrozi, așa că firele subțiri erau folosite ca electrozi intracelulari. Acest lucru a determinat alegerea obiectului - un axon de calmar gigant cu diametrul de 1 mm, în care au fost introduse aceste fire. Pe acest obiect, folosind metoda fixării potențialului cu doi electrozi, cercetătorii au efectuat experimente în care s-a stabilit natura ionică a potențialului de acțiune și s-a postulat pentru prima dată existența canalelor ionice (Premiul Nobel în 1963 , împărtășit cu J. Eccles , care l-a primit pentru cercetări în domeniul transmiterii sinaptice). Blocarea potențialului cu doi electrozi este folosită și astăzi, folosind microelectrozi de sticlă ascuțiți, dar chiar și cu aceștia această tehnică are limitări semnificative: doi electrozi pot fi introduși doar într-o celulă foarte mare (de exemplu, un ovocit de broască).
La sfârșitul anilor șaptezeci ai secolului XX. Erwin Neher (E.Neher) și Bert Sakman (B.Sakmann) au descoperit că pipetele de sticlă în formă de con cu diametrul vârfului de 1-2 microni pot forma contacte cu membrana celulară (limită membrană-sticlă) cu o rezistență de câțiva gigaohmi. - acesta este așa numit contact gigaohm . Vă permite să izolați de mediul extern și de restul membranei acel fragment care se află în interiorul pipetei. Fragmentul de membrană delimitat de pipetă se numește plasture - „fragment”, cuvântul clemă (fixare) din denumirea metodei poate fi interpretat atât ca captare și izolare a acestui fragment, cât și ca fixare a potențialului transmembranar într-un fragment izolat sau, după cum va fi descris mai târziu, potențial sau curent pe întreaga celulă. [9] Un electrod de argint-clor este plasat într-o pipetă umplută cu o soluție de electrolit, al doilea electrod este plasat extracelular, în lichidul de spălare. Circuitul electric diferă de cel descris anterior pentru fixarea cu doi electrozi prin aceea că același electrod este utilizat atât pentru măsurarea diferenței de potențial, cât și pentru aplicarea curentului, ceea ce este posibil datorită rezistenței relativ scăzute a pipetei.
Fotografia 1 arată o parte a unei astfel de configurații.
O sferă uriașă, din care o parte este vizibilă pe monitorul din centrul fotografiei, este o celulă (un ovocit al broaștei Xenopus laevis ), care se află în prezent pe scena microscopului, este conectată o pipetă de plasture, diametrul său la nas este de aproximativ 3 microni. După stabilirea unui contact gigaohm, izolează un fragment al membranei cu o suprafață de aproximativ 7 μm², curentul de la canalele ionice din acest fragment poate fi înregistrat.
Configurația tocmai descrisă se numește patch-clamp atașat la celulă (patch-clamp). Este ilustrat în figura 2.
Această configurație are însă două dezavantaje.
În primul rând, nu permite măsurarea cu suficientă fiabilitate și, în consecință, setarea diferenței de potențial transmembranar, deoarece ambii electrozi, atât pipeta, cât și externi, sunt pe aceeași parte a membranei. În general, este posibil, folosind o soluție de spălare cu o compoziție ionică care imită compoziția citoplasmei , să se depolarizeze membrana în afara pipetei, astfel încât diferența de potențial dintre electrodul extern și citoplasmă să dispară și apoi diferența de potențial. între electrozi va fi egal cu potențialul transmembranar - dar toate acestea sunt foarte aproximative, deoarece compoziția exactă a citoplasmei ne este necunoscută.
În al doilea rând, această configurație nu permite controlul compoziției mediului în afara pipetei - citoplasma rămâne acolo, a cărei compoziție nu este complet determinată.
Cu toate acestea, într-o anumită măsură, această caracteristică a configurației atașate la celulă este, de asemenea, un avantaj: această configurație vă permite să lucrați în condiții care sunt cele mai apropiate de cele fiziologice.
Cu toate acestea, dacă pipeta este îndepărtată din celulă cu o mișcare rapidă, atunci piesa „interioară” a membranei se va desprinde de pe celulă și se va obține o configurație din interior spre exterior (partea exterioară în interior), numită astfel deoarece interiorul partea membranei, de obicei orientată spre citoplasmă, va fi în exterior - în soluția de spălare, iar cea exterioară se află în interiorul pipetei. (Schema 3.) O metodă alternativă de tranziție la configurația din interior spre exterior este următoarea: din configurația atașată la celulă, pipeta este retrasă fără probleme, formând o veziculă închisă pe ambele părți; apoi ridicați pipeta în aer și coborâți-o în a doua baie, cu soluție intracelulară. În timpul transferului, membrana exterioară a veziculei este distrusă, rezultând formarea unei configurații din interior spre exterior.
Acum, diferența de potențial de-a lungul fragmentului de membrană este strict egală cu diferența de potențial dintre electrozi. Evident, atunci când se utilizează această modificare, pipeta este umplută cu o soluție care imită mediul extracelular, în timp ce soluția de spălare se face aproape ca compoziție de citoplasmă . În același timp, prin modificarea compoziției soluției de spălare, este posibil să se studieze modul în care astfel de modificări ale citoplasmei afectează curentul canalelor care ne interesează - la urma urmei, soluția de spălare intră în contact cu partea citoplasmatică a membranei) . În același timp, cunoaștem exact atât compoziția lichidului de pe ambele părți ale membranei, cât și diferența de potențial, ceea ce ne permite să caracterizăm cu precizie canalele folosind ecuațiile biofizice ale lui Nernst și Goldman-Hodgkin-Katz. În același timp, dacă un canal a intrat într-o secțiune izolată a membranei, atunci observăm comportamentul unei singure molecule și, dacă este un receptor -canal reglat de ligand , atunci interacțiunea sa cu alte molecule singulare.
Dacă, conform condițiilor experimentului, este necesară modificarea compoziției mediului extracelular , se poate folosi întreaga configurație celulară . În acest caz, pipeta nu este retrasă din celulă, dar i se aplică presiune negativă și astfel fragmentul izolat al membranei este distrus.
După aceea, pipeta este conectată la mediul intracelular; deoarece celula este de obicei mică, atunci, datorită difuziei , compoziția citoplasmei se dovedește în curând a fi identică cu compoziția soluției de pipetă, prin urmare, ca și în cazul precedent, cunoaștem atât compoziția lichidelor, cât și a diferenta potentiala. Rețineți că, dacă în configurația din interior spre exterior, electrodul pipetei era „extracelular” și electrodul intern era „intracelular”, acum și-au inversat rolurile. Din punctul de vedere al studierii curentului prin canale, avantajul acestei metode este că aici se păstrează structurile celulare și mecanismele de reglare. Adevărat, substanțele cu greutate moleculară mică pot difuza din citoplasmă în pipetă și invers, astfel încât nu se poate realiza conservarea completă a mecanismelor de reglare în această configurație. Un anumit dezavantaj al configurației poate fi considerat că se măsoară curentul total al tuturor canalelor din celulă, și nu curenții prin canale individuale, adică rezoluția acestei metode este mai mică decât cea a configurațiilor cu o membrană ruptă.
Pentru a rezolva problema rezoluției reduse a metodei, configurația exterior- exterior (partea exterioară în exterior) permite. Dacă, după trecerea la modul de celule întregi, pipeta este îndepărtată încet din celulă, membrana nu se desprinde imediat, ci începe să se întindă în tub - acest lucru poate fi văzut în fotografia 5.
Vă rugăm să rețineți că bucățile de citoplasmă sunt clar vizibile în pipetă , care a ajuns acolo după distrugerea membranei în timpul tranziției la întreaga celulă.
Următoarea fază a procesului este prezentată în fotografia 6.
Tubul membranar a devenit foarte subțire și aproape invizibil („ proeminența ” la suprafața celulei este o mică parte a citoplasmei rămase în tubul membranar). În clipa următoare, tubul se va rupe, iar membrana se va închide pe pipetă într-o formă „inversată” - ne vom găsi într -o configurație „în afară”
Deci, pipeta și electrodul său, ca și configurația cu celule întregi, sunt intracelulare, schimbăm liber compoziția soluției extracelulare, zona membranei studiate este mică, astfel încât să putem studia din nou canalele individuale.
Patch-ul perforat este o variantă specifică de patch-clamp în modul celule întregi. În acest caz, soluția pipetă conține o cantitate mică de antibiotic special , de exemplu, amfotericină-B sau gramicidină . Antibioticele din această clasă formează canale ionice în membrana celulară la locul atașat la micropipetă.
Această abordare face posibilă evitarea înlocuirii mediului intern al celulei cu o soluție dintr-o pipetă-electrod, adică celula rămâne în viață cu cât mai puține daune posibile. Astfel, răspunsurile celulei la stimuli sunt cât mai apropiate de cele naturale. În același timp, această metodă are o serie de dezavantaje. În primul rând, în comparație cu modul clasic de celule întregi, rezistența electrică de intrare (care constă în principal din rezistența pipetei și rezistența la joncțiunea pipetei cu membrana) este semnificativ mai mare. Acest lucru scade calitatea potențialului de fixare, crește nivelul de zgomot în timpul înregistrării și crește valorile tuturor erorilor asociate cu modificările rezistenței circuitului complet (de la electrodul din soluția externă la electrodul din pipetă). În al doilea rând, este nevoie de destul de mult timp (până la 30 de minute) pentru ca antibioticul să funcționeze, ceea ce reduce semnificativ perioada utilă a experimentului. Și, în al treilea rând, antibioticul deteriorează, de asemenea, membrana de la joncțiunea cu vârful pipetei, ceea ce duce la distrugerea accelerată a contactului gigaohm și, în plus, reduce timpul efectiv experimental. Astfel, această versiune a metodei poate fi utilizată cu succes numai în experimente care nu necesită mult timp pentru a studia fenomenele studiate.
O variație interesantă a patch-clamp este plasturele nucleat. (Fixarea potențialului cu nucleul celular [11] ).
Metoda este următoarea. Pipeta este adusă în celulă și apoi sparge sacadat prin membrană. După aceea, vârful pipetei este adus la nucleul celulei, se aplică o ușoară presiune negativă pe pipetă. Ca rezultat, pipeta se lipește de nucleu. Apoi pipeta cu miezul la capăt este trasă ușor înapoi și scoasă din cușcă. Pipeta trebuie scoasă din celulă în așa fel încât secțiunea membranei din punctul de ieșire să „pună” nucleul atașat și să se rupă, înfășurându-l în jurul acestuia. Rezultatul este o versiune specifică a plasturelui exterior-out, în care o secțiune mult mai mare a membranei decât în versiunea obișnuită a metodei este atașată la capătul pipetei, fiind înfășurată în jurul nucleului celular.
Când se studiază modificări ale conductanței canalelor de același tip ca răspuns la o acțiune chimică sau dependența conductanței lor de diferența de potențial de-a lungul membranei, este convenabil să se stabilească potențialul și să se măsoare curentul canalului, așa cum am descris. până acum. Acesta, cel mai comun tip de clemă de plasture, se numește clemă de tensiune. Cu toate acestea, uneori, un cercetător este interesat de procesele de transport ionic transmembranar asociate cu o modificare a potențialului membranei - de exemplu, conducerea unui impuls nervos. În astfel de cazuri, puteți face opusul: fixați curentul la un nivel constant și studiați modificările diferenței de potențial în acest caz. Această opțiune se numește clemă de curent (fixare curentă).
Înregistrarea unui singur canal al receptorului de glicină . Două stări sunt clar vizibile: închisă (corespunde unui curent zero) și deschisă (corespunde unui curent de aproximativ 7 picoamperi). Canalul trece spontan de la o stare la alta din când în când, nu există stări intermediare. Înregistrarea vă permite să obțineți două dintre cele mai importante caracteristici ale canalului: conductivitatea (pe baza valorilor potențialului și curentului transmembranar) și probabilitatea de a fi în stare deschisă (definită ca raportul dintre timpul în care canalul este deschisă la momentul în care curentul este înregistrat). Apropo, cel mai adesea activitatea canalului este reglată fiziologic prin modificarea acestei probabilități.
Intrare în configurația întregii celule. Celula epitelială a canalului colector. Potențial transmembranar −60 mV. La intervale de 1 minut timp de 30 de secunde, amilorida, un inhibitor al canalului epitelial de sodiu, este injectată în soluția de spălare (timpul de administrare este indicat prin dreptunghiuri întunecate). Apropo, sensibilitatea la inhibitori este o altă dintre cele mai importante caracteristici ale canalului. Introducerea amiloridei de fiecare dată duce la o scădere a curentului la zero, ceea ce implică faptul că aproape toată conductivitatea la -60 mV în această celulă este conductivitatea canalului epitelial de sodiu . Spre deosebire de înregistrarea anterioară, modificările actuale par a fi continue - acest lucru se datorează faptului că multe canale sunt înregistrate în același timp (aproximativ 2000), respectiv, există aproximativ 2000 de niveluri curente - de la „toate deschise” la „toate închise”.
Aceasta este o tehnică dezvoltată pentru a crește productivitatea în electrofiziologie atunci când sunt necesare măsurători în vrac ale conductanței transmembranare. În special, această metodă își găsește aplicație în cercetarea farmacologică. Dacă cu un patch-clamp clasic pipeta este poziționată pe o celulă staționară, atunci cu una plană, dimpotrivă, suspensia celulară este aplicată pe un microcip cu găuri ordonate de diametru subcelular. Celula se așează pe gaură, aspiră de ea cu ajutorul unei pompe, în urma căreia se formează un contact gigaohm. Mai mult, studiul este efectuat conform aceluiași principiu ca și în clema de plasture tradițională. [12] [13]
Principalul avantaj al patch-clamp planar este că experimentul este mult mai simplu, necesită mai puțină pricepere din partea cercetătorului și necesită mai puțin timp. Destul de multe măsurători pot fi efectuate una după alta automat. Potrivit autorilor tehnicii, această metodă facilitează perfuzarea conținutului intracelular, precum și dozarea mai precisă a substanțelor farmacologice studiate sau testate. Cu această metodă, este relativ ușor să lucrezi cu celule care sunt de obicei în suspensie - în special, cu celule sanguine.
Cu toate acestea, metoda de fixare cu plasture planare are o serie de limitări semnificative. Principalul lucru este că celulele studiate trebuie să fie în suspensie. În consecință, nu este posibil să se lucreze cu fragmente de țesut, este imposibil să se studieze interacțiunea celulelor între ele. Pentru mobilizarea celulelor, este necesar să se utilizeze enzime protează care pot modifica comportamentul canalelor ionice studiate.
Toate cele de mai sus conduc la faptul că patch-clamp planar își găsește aplicație în principal în studiile de screening farmacologic în care sunt necesare măsurători de masă, dar nu este atât de comună în domeniul științei fundamentale.