Reacție în lanț a polimerazei în timp real

Reacția în lanț a polimerazei în timp real (sau PCR cantitativă, qPCR, PCR-RT, ing.  PCR în timp real, qPCR ) este o metodă de laborator bazată pe metoda reacției în lanț a polimerazei care vă permite să determinați nu numai prezența nucleotidei țintă secvența în probă, dar și măsurarea numărului de copii. Cantitatea de ADN amplificat este măsurată după fiecare ciclu de amplificare folosind etichete fluorescente : sonde sau intercalatoare . Evaluarea poate fi cantitativă (măsurarea numărului de copii ale șablonului) și relativă (măsurarea relativă la ADN-ul introdus sau genele de calibrare suplimentare ) [1] .

O metodă de PCR cantitativă modificată se numește PCR semi-cantitativă (PCR semi-cantitativă). Este adesea folosit pentru a compara expresia mai multor gene. În acest caz, cantitatea de produs acumulat este măsurată doar la un moment dat - după ce reacția sa oprit. [2]

PCR în timp real este adesea combinată cu alte metode: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR etc. [3]

Descrierea metodei

Procedura qPCR este similară cu procedura PCR clasică , adică toate etapele reacției sunt prezente - topirea ADN-ului dublu catenar la o temperatură de 95˚C, recoacere a primerilor (temperatura de recoacere depinde de primerii utilizați) și alungirea la o temperatură de 72˚C dacă se utilizează polimeraza Taq . Cantitatea de produs PCR este măsurată în fiecare ciclu PCR utilizând etichete fluorescente . Astfel, puterea semnalului indică cantitatea inițială a moleculei de interes [4] .

Trama de amplificare

Nomenclatura folosită în mod obișnuit pentru qPCR este:

  1. Linia de bază sunt cicluri PCR în care semnalul fluorescent este sub valoarea pe care instrumentul o poate detecta.
  2. ΔRn este incrementul semnalului fluorescent în fiecare moment de timp.
  3. Linia de prag este un nivel arbitrar de fluorescență selectat pe baza liniei de bază. Un semnal care este detectat peste prag este considerat un semnal real, care poate fi utilizat pentru a determina ciclul de prag (Ct) pentru probă. Pragul poate fi ajustat pentru ca fiecare experiment să fie în regiunea exponențială pe toate diagramele.
  4. Numărul prag de cicluri (Ct) este numărul de cicluri PCR la care fluorescența depășește valoarea pragului.

Graficul constă dintr-o linie de bază, o fază exponențială și un platou [5] .

În stadiile inițiale, fluorescența este slabă, deoarece există puțin produs, deci este dificil să-l distingem de fundal. Pe măsură ce produsul se acumulează, semnalul crește exponențial la început și apoi atinge un platou. Platoul se datorează lipsei uneia sau alteia componente a reacției - primeri , trifosfați de nucleotide , se poate epuiza o etichetă fluorescentă. Dacă s-a acumulat prea mult produs de reacție, atunci polimeraza poate deveni un factor limitator și apoi dependența cantității de produs de ciclu va deveni liniară . Este demn de remarcat faptul că într-o reacție standard PCR în timp real, toate probele vor plati și vor atinge aproximativ același nivel de semnal. Astfel, punctul final nu va spune nimic despre cantitatea inițială a probei de testat. Pe de altă parte, în faza exponențială se pot urmări diferențe în rata de creștere a cantității de produs. Diferențele în numărul inițial de molecule afectează numărul de cicluri necesare pentru a ridica nivelul de fluorescență peste nivelul de zgomot [5] .

Ct este un număr care poate fi folosit pentru a evalua cantitatea de ADN țintă în soluție, dar valoarea Ct poate depinde de mulți factori aleatori, cum ar fi sensibilitatea detectorului , calitatea filtrului etc. Prin urmare, cantitatea inițială exactă a produsului de interes nu poate fi măsurat. Există metode de normalizare pentru a rezolva această problemă . Măsurați raportul dintre cantitățile a două molecule din probă. Ele sunt de obicei normalizate la produsele genelor de întreținere  - gene, al căror număr într-o celulă este întotdeauna aproximativ același (un exemplu este gena infA, care codifică factorul de inițiere a translației în bacterii ) . Raportul este determinat de următoarea formulă:

unde și  sunt cantitățile inițiale ale celor două eșantioane, Ct B și Ct A  sunt valorile Ct corespunzătoare și  este eficiența PCR, care este adesea echivalată cu sau [5] .

Analiza curbei de topire

PCR în timp real permite identificarea fragmentelor specifice de ADN amplificate utilizând o analiză a temperaturii lor de topire (denaturare), denumită și valoarea Tm. Metoda folosește coloranți intercalați , de obicei SYBR Green . Punctul de topire al ADN-ului este specific fragmentului amplificat. Rezultatele acestei metode au fost obținute prin compararea curbelor de disociere ale probelor de ADN analizate. Două curbe de topire sunt trasate pentru analiză. Prima este dependența fluorescenței de timp, a doua este rata de scădere a fluorescenței în timp. Vârful reflectă un model specific de ADN [5] .

Clasificarea fluoroforilor uzați

Definiție nespecifică: PCR cantitativă cu coloranți de legare la ADN dublu catenar ca reporteri

În acest caz, eticheta este un compus chimic capabil să se încorporeze în dublu helix ADN . O astfel de sondă își schimbă conformația la interacțiunea cu produsele PCR și devine un fluorofor . Determinarea produsului poate fi efectuată la sfârșitul fiecărui ciclu, înainte de etapa de denaturare . Un exemplu de astfel de vopsea este SYBR Green, folosit pe scară largă. Cu toate acestea, coloranții ADN dublu catenar (dsDNA) se vor lega la toate dsDNA, inclusiv produsele PCR nespecifice (cum ar fi dimerul primer ). Acest lucru poate interfera cu acuratețea monitorizării secvenței țintă [6] .

Definiție specifică: sondă reporter fluorescent

Sondele fluorescente detectează numai secvența care conține ADN complementară sondei; prin urmare, utilizarea unei sonde reporter crește foarte mult specificitatea și permite o măsurare mai precisă în prezența altor dsDNA . Cu toate acestea, sondele reporter fluorescente nu împiedică efectul inhibitor al dimerilor de primer, care pot suprima acumularea produșilor de reacție țintă [7] .

De asemenea, este posibil să se utilizeze mai multe sonde ale căror fluorofore au spectre de emisie diferite . În acest caz, devine posibilă înregistrarea unui semnal de la diferite molecule de ADN într-un tub. Metoda se numește PCR multiple (ing. PCR multiplex ) [8] .

Metoda se bazează pe introducerea unei sonde ADN complementară produsului de amplificare cu un reporter fluorescent la un capăt al sondei și un extintor de fluorescență la capătul opus. Când extinctorul se află în imediata apropiere a reporterului, acesta absoarbe semnalul și reporterul nu emite fluorescență . În timpul amplificării , integritatea sondei este ruptă, iar reporterul poate fi detectat prin fluorescență după excitarea cu laser. Prin urmare, creșterea cantității de produs la care se leagă sonda reporter în fiecare ciclu PCR determină o creștere proporțională a fluorescenței . Etichetele pot fluoresce în faza de alungire sau în faza de recoacere PCR [4] .

Un fluorofor și stingerea acestuia sunt cusute pe sondă de la capetele 5’ și 3’ . Dacă secvența sondei nu este foarte lungă, atunci chiar și în starea legată de ADN vor interacționa între ele și nu va fi emisă nicio fluorescență. În timpul alungirii , ADN polimeraza , care are activitate 5'-3'-exonuclează (deseori folosită polimeraza Taq ), disociază sonda de ADN-ul țintă câte o nucleotidă . Ca urmare a acestui proces, atât fluoroforul, cât și stingătorul său vor intra în soluție, unde probabilitatea de a găsi aceste substanțe în apropiere va fi mică, iar fluorescența va fi restabilită [4] .

  1. Un ac de păr fluorogen  este o moleculă mică de ADN monocatenar care, în starea sa liberă, este capabilă să formeze o structură spațială specială a ADN-ului - un ac de păr . Un fluorofor este cusut la un capăt al lanțului, iar o substanță care îl stinge este cusut la celălalt. Secvența sondei este complementară ADN-ului țintă. În acest caz, acele molecule sondă care plutesc în soluție nu vor da un semnal fluorescent, iar cele legate de moleculele de ADN vor suferi modificări conformaționale , care vor avea ca rezultat separarea spațială a fluoroforului și a stingerii acestuia și restabilirea fluorescenței. Înregistrarea se recomandă să se efectueze după denaturare [4] .
  2. O etichetă bazată pe metoda FRET . Baza acestei metode este prezența a două sonde care se leagă de ADN-ul țintă la o distanță mică una de cealaltă. Un donor de fluorofor și un acceptor de fluorofor sunt suturați la capătul 5’ al unei sonde și , respectiv, capătul 3’ al celei de-a doua sonde. Când sunt apropiate, fluoroforul donor absoarbe lumina de o anumită lungime de undă și emite o strălucire într-un spectru de lungimi de undă mai lungi . Această undă, la rândul său, este absorbită de fluoroforul acceptor și emite lumina înregistrată. [4] .

Aplicație

PCR în timp real este utilizat pe scară largă pentru multe aplicații de cercetare în laboratoare. În plus, această metodă și-a găsit aplicație în medicină (pentru diagnosticarea bolilor) și în domeniul biotehnologiei (pentru determinarea conținutului de microorganisme în alimente și materiale vegetale; pentru detectarea OMG-urilor ). qPCR este, de asemenea, utilizat pentru genotiparea și cuantificarea virusurilor și a altor agenți patogeni umani.

Cercetare științifică

Cuantificarea expresiei genelor

qPCR este utilizat ca una dintre metodele de măsurători cantitative ale transcripției genelor . Această metodă este utilizată pe scară largă pentru a evalua modificările în expresia unei anumite gene de-a lungul timpului , de exemplu, ca răspuns la administrarea unui medicament sau la modificările condițiilor de mediu. Cuantificarea expresiei genelor folosind metode tradiționale de detectare a ADN-ului este nesigură. Detectarea ARNm prin Northern blot , produse gel-PCR sau Southern blot nu permite o cuantificare precisă. De exemplu, în 20-40 de cicluri ale unei PCR tipice, cantitatea de produs ADN atinge un platou care nu este direct legat de cantitatea de ADN țintă din PCR inițial [9] .

PCR în timp real poate fi utilizată pentru cuantificarea acizilor nucleici prin două metode comune: cuantificare relativă și cuantificare absolută [10] . Cuantificarea absolută oferă numărul exact de molecule de ADN țintă folosind o curbă standard . Prin urmare, este important ca PCR-ul probei și al standardului să aibă aceeași eficiență de amplificare . Scorul relativ se bazează pe gene de referință interne (gene de întreținere ) pentru a determina diferențele de ori în expresia genei țintă. Cuantificarea este exprimată ca o modificare a nivelurilor de expresie ale ARNm interpretat ca ADN complementar ( ADNc , generat prin transcripție inversă ARNm ). Cuantificarea relativă este mai ușor de efectuat deoarece nu necesită o curbă de calibrare deoarece cantitatea de genă studiată este comparată cu cantitatea de genă de control [11] .

qPCR pentru a determina cantitatea de ARN nuclear mic (ARNsn)

ARN-urile nucleare mici (ARNsn) diferă în proprietăți de ARNm printr-o lungime foarte scurtă (aproximativ 22 de nucleotide ), nu au o secvență conservatoare la capete, în timp ce ARNsn dintr-o populație pot diferi prin una sau mai multe nucleotide . Pentru a rezolva aceste probleme, se folosesc abordări bazate pe adăugarea unei mici bucăți de ADN (linker) la ADNc într-o reacție de transcripție inversă . Apoi, PCR în timp real este efectuată prin metode standard folosind primeri, (biologie)|complementari linkerului [12] .

Studii genomice folosind ChIP-qPCR

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) în combinație cu RT-qPCR este considerată a fi metoda de bază în cercetarea genomică , disponibilitatea sa comercială și acuratețea ridicată permit analiza rapidă și ușoară a interacțiunilor proteină-ADN. ChIP-qPCR este utilizat pentru a investiga gene specifice și regiuni de reglare potențiale, cum ar fi promotorii . Această metodă este utilizată în prezent în diferite studii, inclusiv diferențierea celulelor , tăcere a genei supresoare și efectul modificărilor histonelor asupra expresiei genelor [13] .

Analiza ChIP captează doar o fracțiune din țintele posibile prezente în întregul genom datorită variabilității eficienței de reticulare și limitării sterice a disponibilității anticorpilor [13] .

Pentru a efectua ChIP-qPCR, este necesar să adăugați amestecul principal (un amestec de enzime și nucleotide ), primeri și ADN șablon. În acest caz, este necesar să se selecteze cu precizie concentrația de primeri pentru amplificarea eficientă a ADN-ului țintă. Fie ADN-ul ChIP servește ca șablon, fie, în cazul unui control negativ, mărgele goale fără ADN. Apoi este necesar să alegeți timpul și temperatura ciclurilor de recoacere și să începeți PCR. Rezultatele sunt analizate în mod similar cu rezultatele qPCR, comparând numărul prag de cicluri (Ct) pentru șablonul de intrare și șablonul ADN ChIP [3] .

Diagnosticare medicală

PCR cantitativ este utilizat pentru identificarea rapidă a genelor sau fragmentelor de ADN care sunt markeri ai bolilor infecțioase , anomaliilor genetice etc. Introducerea acestei metode în laboratoarele clinice a îmbunătățit semnificativ calitatea diagnosticării bolilor infecțioase [14] . În plus, qPCR este folosită ca instrument pentru detectarea bolilor nou apărute. De exemplu, noi tulpini de gripă [15] .

Utilizarea qPCR permite, de asemenea, măsurători cantitative și genotipare (caracterizarea tulpinilor) de virusuri , cum ar fi virusul hepatitei B [16] . Gradul de infecție , care este măsurat ca număr de copii ale genomului viral pe unitatea de țesut a pacientului, este de mare importanță. De exemplu, probabilitatea reactivării virusului herpes simplex tip 1 depinde de numărul de ganglioni infectați [17] .

La pacienții cu suspiciune de infecție cu coronavirus , se ia un tampon în gât, se extrage ARN și se analizează prin RT-qPCR . Genele țintă sunt cadrul deschis de citire 1ab (ORF1ab) și proteina nucleocapsidă (N). Un prag de ciclu (valoare Ct) mai mic de 37 este definit ca un rezultat pozitiv al testului, iar o valoare Ct de 40 sau mai mult este definit ca un rezultat negativ al testului. Aceste criterii de diagnostic se bazează pe recomandările Institutului Național pentru Controlul și Prevenirea Bolilor Virale [18] .

Sensibilitatea testului RT-qPCR este de 83,3%, acest test fiind predispus la rezultate fals negative . De asemenea, tomografia computerizată este folosită pentru a diagnostica coronavirusul , a cărui sensibilitate este mult mai mare și se ridică la 97,2% [19] .

PCR cantitativ este, de asemenea, utilizat pe scară largă pentru a detecta celulele tumorale în tumorile solide [20] [21] și chiar în unele forme de leucemie [22] [23] .

qPCR ajută la detectarea celulelor tumorale circulante . De exemplu, cancerul de sân este încă cea mai frecventă cauză de deces în rândul pacienților cu cancer. În plus, moartea este adesea cauzată de metastaze care au apărut . Metastazele apar ca urmare a faptului că celulele capabile de proliferare sunt separate de tumoră , intră în fluxul sanguin și se stabilesc din nou într-o anumită parte a corpului. Aceste celule sunt numite celule stem circulante (CSC). Prezența unor astfel de celule în sângele pacienților cu cancer de sân, de regulă, este asociată cu un prognostic slab al rezultatului terapiei și al supraviețuirii în general, prin urmare, este un parametru de diagnostic foarte important. Dar, din cauza numărului foarte mic, identificarea CVT  este o sarcină dificilă.

Și qPCR ca metodă extrem de sensibilă poate fi folosită pentru a rezolva această problemă. CST - urile sunt de origine epitelială și, prin urmare, exprimă un anumit set de gene care diferă de celulele sanguine din jurul lor , care sunt de origine mezenchimală . Pentru a aplica această metodă, este necesar să se determine setul de gene marker CST și să se evalueze nivelul de expresie al acestora [24] .

În microbiologie

PCR-ul în timp real este utilizat și pentru lucrări microbiologice în domeniul siguranței alimentelor, pentru evaluarea calității apei (potabile și uzate) și în domeniul sănătății publice [25] . În plus, această metodă este utilizată pentru identificarea microflorei intestinale [26] .

Detectarea fitopatogenilor

Agroindustria produce semințe și răsaduri fără agenți patogeni pentru a preveni pierderile economice și a crește durata de valabilitate a produselor. Prin urmare, au fost dezvoltate sisteme pentru a detecta cantități mici de phytophthora ( Phytophthora ramorum ), oomycete și alți alți agenți patogeni care ucid stejarii și alte specii de plante amestecate cu ADN-ul plantei gazdă. Capacitatea de a distinge între ADN-ul agentului patogen și al plantei gazdă se bazează pe amplificarea secvențelor ITS ( intern transcrited spacer) , regiuni interne transcrise situate în regiunea codificatoare a genei ARN ribozomal , care sunt caracteristice fiecărui taxon [27]. ] .

Identificarea organismelor modificate genetic

qPCR (folosind transcrierea inversă ) poate fi utilizată pentru a detecta organisme modificate genetic , deoarece este mai sensibilă decât multe alte metode. În acest caz, primeri specifici sunt utilizați pentru a amplifica promotorul, terminatorul sau secvențele intermediare utilizate în procesul de creare a vectorului . Deoarece procesul de creare a unei plante transgenice are ca rezultat, de obicei, inserarea a mai mult de o copie a transgenei , cantitatea acesteia este, de asemenea, estimată utilizând qPCR. În acest caz, o plantă care conține această genă într-o singură copie este utilizată ca martor [28] [29] .

Note

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM Douăzeci și cinci de ani de PCR cantitativă pentru  analiza expresiei genelor //  Biotehnici : jurnal. - 2008. - Vol. 44 . - P. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. PCR semi-cantitativă pentru cuantificarea cianobacteriilor hepatotoxice  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , nr. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP–Reacția cantitativă a polimerazei în lanț (ChIP-qPCR)  (engleză)  // Protocoale Cold Spring Harbor. — 2018-05. — Vol. 2018 , iss. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Tehnici complementare: validarea datelor de exprimare a genelor prin PCR cantitativă în timp real.  (Engleză)  // Progrese în medicină și biologie experimentală. - 2007. - Vol. 593 . - P. 66-73 . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N. Reacția în lanț a polimerazei în timp real.  (Engleză)  // Aspecte moleculare ale medicinei. - 2006. - Aprilie ( vol. 27 , nr. 2-3 ). - P. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. Cuantificarea bacteriofagelor M13 și T7 de către TaqMan și SYBR green qPCR  (engleză)  // Journal of Virological Methods. — 2018-02. — Vol. 252 . — P. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M.J. Castaño, J. Solera. Real-time PCR detection chemistry  (English)  // Clinica Chimica Acta. — 2015-01. — Vol. 439 . — P. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Arhivat la 1 mai 2020.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Guest. Analize multiplex utilizând tehnici de PCR cantitative în timp real  //  Multiplex Biomarker. — New York, NY: Springer New York, 29.11.2016. — P. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. Utilizarea PCR în timp real a transcriptazei inverse pentru cuantificarea expresiei genelor citokinelor  // Journal of biomolecular techniques: JBT. — 2003-03. - T. 14 , nr. 1 . — p. 33–43 . — ISSN 1524-0215 ​​​​. Arhivat din original pe 29 aprilie 2016.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Compararea diferitelor standarde pentru cuantificarea absolută în timp real bazată pe PCR  // Journal of Immunological Methods. — 31-03-2010. - T. 354 , nr. 1-2 . — p. 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Arhivat din original pe 2 martie 2019.
  11. ↑ Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Manual PCR în timp real / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Tehnologii de viață (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. — 68 s.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. Profilarea expresiei microARN folosind PCR cantitativ în timp real, cum să-l folosească și ce este disponibil.  (engleză)  // Metode (San Diego, California). - 2010. - Aprilie ( vol. 50 , nr. 4 ). - P. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. Cum să combinați ChIP cu qPCR  //  Imunoprecipitarea cromatinei / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Vol. 1689 . — P. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Aplicații în microbiologie clinică. PCR în timp real: tehnologie și aplicații actuale . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ FDA autorizează utilizarea de urgență a medicamentelor pentru gripă, test de diagnostic ca răspuns la focarul de gripă porcină la oameni. FDA News, 27 aprilie 2009.
  16. ^ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Cuantificarea și genotiparea virusului hepatitei B într-o singură reacție prin PCR în timp real și analiza curbei de topire.  (engleză)  // Journal of Hepatology. - 2004. - octombrie ( vol. 41 , nr. 4 ). - P. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Probabilitatea reactivării in vivo a virusului herpes simplex tip 1 crește odată cu numărul de neuroni infectați latent din ganglioni.  (Engleză)  // Journal Of Virology. - 1998. - August ( vol. 72 , nr. 8 ). - P. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. Caracteristicile clinice ale a 138 de pacienți spitalizați cu pneumonie nou infectată cu coronavirus din 2019 în Wuhan, China   // JAMA . — 17.03.2020. — Vol. 323 , iss. 11 . - P. 1061 . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Arhivat la 1 aprilie 2020.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. Diagnosticul bolii cu coronavirus (COVID-19): rRT-PCR sau CT?  (Engleză)  // Jurnalul European de Radiologie. — 2020-05. — Vol. 126 . — P. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Arhivat 14 mai 2020.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Circulating tumor cells in the diagnostic and management of cancer pancreatic.  (Engleză)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - Decembrie ( vol. 1826 , nr. 2 ). - P. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Circulating tumor cells in pulmonar cancer.  (engleză)  // Acta Cytologica. - 2012. - Vol. 56 , nr. 6 . - P. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Leucemia limfoblastică acută: monitorizarea bolii reziduale minime ca principiu terapeutic.  (Engleză)  // Seminarii În Oncologie. - 2012. - Februarie ( vol. 39 , nr. 1 ). - P. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM Dincolo de morfologie: detectarea minimă a bolii reziduale în leucemia mieloidă acută.  (Engleză)  // Opinia curentă în hematologie. - 2012. - martie ( vol. 19 , nr. 2 ). - P. 82-88 . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Detection of Circulating Tumor Cells from Blood of Breast Cancer Patients prin RT-qPCR.  (engleză)  // Raci. - 2013. - 25 septembrie ( vol. 5 , nr. 4 ). - P. 1212-1220 . - doi : 10.3390/cancers5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (editor) (2012). PCR cantitativ în timp real în microbiologie aplicată , Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotice: Efectele asupra sănătății umane și perspectivele actuale   // Probiotice . - 2012. - 3 octombrie. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG Utilitatea filogenetică a distanțierilor transcriși interni ai ADN-ului ribozomal nuclear la plante: un exemplu din compozite.  (Engleză)  // Filogenetică moleculară și evoluție. - 1992. - Martie ( vol. 1 , nr. 1 ). - P. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG Tehnologia PCR pentru screening-ul și cuantificarea organismelor modificate genetic (OMG).  (Engleză)  // Chimie analitică și bioanalitică. - 2003. - Aprilie ( vol. 375 , nr. 8 ). - P. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Metode de reacție în lanț a polimerazei cantitative în timp real pentru patru soiuri de porumb modificate genetic și conținut de ADN din porumb în alimente.  (Engleză)  // Jurnalul AOAC Internațional. - 2002. - Mai ( vol. 85 , nr. 3 ). - P. 646-653 . — PMID 12083257 .

Literatură

  • Glick B., Pasternak J. Biotehnologie moleculară. Principii și aplicare. - Moscova: Mir, 2002. - 589 p. — ISBN 5030033289 .