| proteaza TEV | |
|---|---|
| Identificatori | |
| Cod KF | 3.4.22.44 |
| numar CAS | 139946-51-3 |
| Baze de date de enzime | |
| IntEnz | Vedere IntEnz |
| BRENDA | intrare BRENDA |
| ExPASy | Vedere NiceZyme |
| MetaCyc | cale metabolică |
| KEGG | intrare KEGG |
| PRIAM | profil |
| Structuri PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum |
| Căutare | |
| PMC | articole |
| PubMed | articole |
| NCBI | proteine NCBI |
| CAS | 139946-51-3 |
| Fișiere media la Wikimedia Commons | |
TEV proteaza (din limba engleză Tobacco E tch Virus - tobacco engraving virus ) este o cisteină protează foarte specifică a virusului gravării tutunului. Aparține superfamiliei PA de proteaze asemănătoare chimotripsinei. Datorită specificității sale mari de secvență, este adesea folosit pentru digestia controlată a proteinelor de fuziune in vitro și in vivo . [unu]
Întregul genom al virusului de gravare a tutunului codifică o singură poliproteină masivă (350 kDa) care este scindată în blocuri funcționale de trei proteaze: proteaza P1 (1 situs de scindare), HC-Pro (1 situs de scindare) și proteaza TEV (7 situsuri de scindare) . [2] Proteaza nativă conține, de asemenea, un situs intern de auto-clivare. Acest loc este scindat lent pentru a inactiva enzima (motivul fiziologic pentru aceasta este necunoscut).
Structura proteazei TEV a fost determinată folosind cristalografie cu raze X. [3] Enzima constă din doi cilindri β și un capăt C-terminal flexibil, care prezintă omologie structurală cu superfamilia tripsin-proteazelor (clanul PA, familia C4 conform clasificării MEROPS). [4] În ciuda omologiei cu serin proteaze (cum ar fi tripsina , elastaza, trombina etc.), proteaza TEV utilizează cisteina ca sit catalitic [5] (la fel ca multe alte proteaze virale).
Cataliza covalentă are loc printr-o triadă Asp-His-Cys împărțită între doi cilindri β (Asp este pe β1 și His și Cys sunt pe β2). [6] Substratul este ținut într-o foaie β, formând o interacțiune anti-paralelă cu canelura dintre cei doi cilindri și o interacțiune paralelă cu capătul C-terminal. [7] Astfel, enzima formează un tunel de legare în jurul substratului, iar interacțiunile lanțului lateral oferă specificitate. [3]
Secvența naturală de clivaj a fost mai întâi determinată prin examinarea situsurilor de clivaj din substratul poliproteic nativ pentru secvența repetată. Secvența consens pentru situsul nativ de clivaj este ENLYFQ\S (unde „\” denotă o legătură peptidică scindabilă). [8] Reziduurile de aminoacizi ale substratului sunt numerotate de la P6 la P1 înainte de locul de clivaj și P1' după excizie. Lucrările timpurii au evaluat, de asemenea, scindarea unei serii de substraturi similare pentru a determina cât de specifică ar scinda enzima secvența nativă. [9] [10]
Studiile au folosit ulterior secvențierea substraturilor scindabile dintr-un grup de secvențe randomizate pentru a determina modelele preferate. [11] [12] Deși ENLYFQ\S este secvența optimă, proteaza este mai mult sau mai puțin activă pe diferite substraturi (adică prezintă o oarecare variabilitate). Scindarea cea mai eficientă are loc în secvențele cele mai asemănătoare cu consensul EXLYΦQ\φ, unde X este orice rest de aminoacid, Φ este orice reziduu hidrofob mare sau mediu și φ este orice rest mic de aminoacid hidrofob sau polar.
Specificitatea este asigurată de o zonă mare de contact între enzimă și substrat. Proteazele, cum ar fi tripsina , sunt specifice pentru un rest de aminoacid înainte și după legătura scindabilă printr-un spațiu de legare mică cu doar una sau două buzunare care leagă lanțurile laterale ale substratului. Dimpotrivă, proteazele virale, cum ar fi proteaza TEV, au o coadă C-terminală lungă care închide complet substratul pentru a crea un tunel de legare. Acest tunel conține un set de buzunare de legare astfel încât fiecare lanț lateral al substratului peptidic (P6 la P1') se leagă la un situs complementar (C6 la C1'). [3]
În special, lanțul lateral peptidic al P6-Glu intră în contact cu o rețea de trei legături de hidrogen; P5-Asn indică un solvent fără a crea interacțiuni specifice (din acest motiv, nu există un consens asupra secvenței substratului în această poziție); P4-Leu se scufundă într-un buzunar hidrofob; P3-Tyr este ținut într-un buzunar hidrofob cu o legătură scurtă de hidrogen la capăt; P2-Phe este, de asemenea, înconjurat de reziduuri hidrofobe, inclusiv suprafața triadei histidinei; P1-Gln formează patru legături de hidrogen; și P1'-Ser este doar parțial închis într-un canal hidrofob de mică adâncime. [3]
Una dintre principalele utilizări ale acestei enzime este îndepărtarea etichetelor de afinitate din preparatele de proteine de fuziune purificate . Motivul utilizării proteazei TEV ca instrument biochimic este specificitatea sa mare de secvență. Acest lucru îl face relativ netoxic in vivo , deoarece secvența pe care o recunoaște nu se găsește aproape niciodată în proteine. [13]
Deși proiectarea rațională a avut un succes limitat în modificarea specificității proteazei, evoluția dirijată a fost folosită pentru a schimba reziduul preferat înainte [14] sau după [15] [16] locul de clivaj.
Proteaza TEV are limitări în utilizarea sa. Este predispus la dezactivare prin auto-clivaj, deși acest lucru poate fi evitat prin mutația S219V la locul de clivaj intern [17] . Proteaza exprimată singură este slab solubilă; Au fost făcute mai multe încercări de a îmbunătăți solubilitatea acestuia prin evoluție direcționată și simulări pe computer. În plus, s-a demonstrat că expresia poate fi îmbunătățită prin fuziunea cu o proteină care leagă maltoza , care crește solubilitatea partenerului.
Greutatea moleculară a acestei enzime variază de la 25 la 27 kDa, în funcție de construcția utilizată.