Secvențierea în timp real cu o singură moleculă sau SMRT este o metodă de secvențiere a ADN-ului de nouă generație dezvoltată de Pacific Biosciences .
Ideea metodei este de a determina secvența ADN prin monitorizarea activității unei singure molecule de ADN polimerază în timp real. În același timp, ADN polimeraza completează a doua catenă a moleculei de ADN studiată folosind nucleotide marcate cu diferite etichete fluorescente ; prin înregistrarea datelor etichetei, este posibil să înțelegem ce nucleotidă introduce ADN polimeraza în prezent.
Dispunerea secventientelor de acest tip face posibila observarea, la nivelul unei singure molecule, a sintezei catenei complementare a unei molecule de ADN monocatenar cu ajutorul unei molecule de ADN polimeraza. În această tehnologie, nucleotidele marcate fluorescent și microscopia confocală de înaltă rezoluție permit secvențierea în timp real și simultană a multor polimeraze [1] .
ZMWMetoda se bazează pe utilizarea ghidului de undă Zero-mode (ZMW) - depresiuni de câteva zeci de nanometri în diametru , la baza cărora este atașată o singură moleculă de ADN polimerază. Lumina este alimentată prin partea de jos în celula ZMW. Caracteristica de proiectare a celulei ZMW nu permite propagarea undei luminoase și lasă doar un volum de aproximativ 20 de zeptolitri (20 × 10 -21 litri) lângă partea de jos a celulei iluminat. Acest lucru face posibilă observarea fluorescenței unei singure etichete fluorescente atașate la nucleotida introdusă în mod curent de către ADN polimeraza. În consecință, pe cele patru tipuri de nucleotide sunt cusute diferite etichete fluorescente, ceea ce face posibilă distingerea acestora. Ca urmare, în timpul polimerizării unui lanț de ADN de către o enzimă fixată în ZMW, este posibil să se obțină dependența intensității fluorescenței în timp, din graficul căruia secvența ADN este determinată din vârfurile unui spectru diferit . 1] .
La secvențiere se folosesc așa-numitele celule SMRT , care conțin aproximativ 150.000 de celule ZMW, care sunt depresiuni într- un film de aluminiu depus pe un substrat de siliciu [2] .
NucleotideAceastă metodă utilizează etichete ( fluorofore ) atașate grupului fosfat terminal al nucleotidei. O astfel de etichetă are un efect mai mic asupra funcționării ADN polimerazei, ceea ce este extrem de important pentru secvențierea în timp real. În procesul de adăugare a unei nucleotide la catena de ADN în creștere, eticheta este scindată de ADN polimerază împreună cu pirofosfat . Ca urmare, fluoroforul poate difuza în afara volumului observat și nu mai afectează semnalul înregistrat, iar nucleotida este integrată în lanțul ADN fără „greutări”. Astfel, prin măsurarea unei străluciri pe termen lung (milisecunde) de o culoare atunci când o nucleotidă marcată este atașată de o polimerază pe un fundal de difuzie rapidă (microsecunde) patru, este posibil să se determine secvența lanțului șablon ADN [1] .
Metoda de secvențiere în timp real cu o singură moleculă face posibilă obținerea de citiri foarte lungi (secvențe ADN) (în medie, aproximativ 20.000 de nucleotide, până la 60.000 de nucleotide), ceea ce facilitează analiza ulterioară a datelor și evită o serie de probleme care apar atunci când se lucrează. cu citiri scurte. Funcționează fără amplificarea prealabilă a ADN-ului investigat prin intermediul PCR . Această metodă oferă o viteză mare de secvențiere (în teorie, este limitată doar de viteza ADN polimerazei) [1] . Metoda se caracterizează prin sensibilitate și specificitate ridicate: posibilitatea de a detecta variante minore în probe mixte cu o frecvență de apariție mai mică de 0,1%. De asemenea, permite secvențierea de înaltă fidelitate. Momentan nu este foarte mare (83%), dar precizia poate fi îmbunătățită prin secvențierea repetată a moleculei de ADN (> 99% la 15 repetări) [3] [4] .
Dezavantajele metodei includ costul ridicat al dispozitivului - 600.000 USD [5] . Se caracterizează printr-un nivel relativ ridicat de erori datorită intersecției spectrelor de emisie ale fluoroforilor. În plus, atașarea aleatorie a polimerazelor la fundul celulei ZMW duce la o distribuție Poisson a numărului de enzime per celulă [1] .
Lungimea citirilor de secvențiere în timp real cu o singură moleculă este comparabilă sau mai mare decât în metoda Sanger , ceea ce face posibilă secvențierea de novo a genomilor și simplifică asamblarea acestora [1] . Citirile lungi oferă contextul necesar pentru a localiza corect pozițiile repetate în genom. Capacitatea de a obține porțiuni lungi de ADN în timpul secvențierii este, de asemenea, importantă pentru metagenomică : este posibil să se identifice organisme în populații mixte - de exemplu, în microbiom . Deoarece sunt necesare mai puține citiri ale acelorași regiuni pentru a asambla genomul, descifrarea genomului prin această metodă necesită mai puțin efort. Secvențierea în timp real cu o singură moleculă a fost demonstrată pe secvențierea de novo a genomului în studii care analizează focarul de infecție intestinală germană din 2011 și epidemia de holeră din 2010 din Haiti [6] [7] .
Tehnologia de secvențiere de „a treia generație”, combinată cu metode mai vechi, poate crește acuratețea ansamblării genomului. Sequencerele de a doua generație sunt capabile să citească genomul în fragmente mici de 100-700 de perechi de baze, dar astfel de citiri sunt apoi dificil de adunat în ordinea corectă. Instrumentele de „a treia generație” (în special PacBio RS de la Pacific Biosciences) pot genera citiri de până la 23 kb, dar fac mai multe erori decât poate gestiona software-ul obișnuit de analiză genomică. În 2011, oamenii de știință de la Centrul Național de Analiză și Contramăsuri pentru Biodefense ( SUA ) au folosit citiri scurte obținute în timpul secvențierii pe instrumente Illumina și Roche 454 de a doua generație pentru a corecta erorile în citirile lungi generate de secvențiatorul PacBio RS. După testarea algoritmului dezvoltat pe genomii bacteriei Escherichia coli și a drojdiei , precum și pe transcriptomul de porumb , cercetătorii au descoperit că precizia de asamblare poate fi crescută de la 83 la 99,9%. Oamenii de știință au aplicat, de asemenea, metoda de ajustare hibridă dezvoltată pentru asamblarea unui genom de budgerigar nesecvenționat anterior [8] .
În 2012, a fost utilizată o abordare hibridă pentru a asambla genomul tulpinii de holeră care a provocat epidemia din Haiti din 2010 . Regiunile genomului bacterian care sunt importante pentru tratamentul bolii au fost colectate cu o acuratețe ce depășește 99,9% [9] .
Aceeași moleculă de ADN poate fi resecvențializată în mod independent folosind un șablon circular de ADN și o enzimă care separă catena de ADN nou sintetizată de șablon. Acest lucru este important pentru analiza și diagnosticarea diferitelor boli. Comparând milioane și miliarde de citiri cu textul original, puteți obține o listă completă a diferențelor dintre genomul studiat și „standardul de aur” . Mai mult, dacă fiecare literă a textului sursă este verificată prin citiri multiple, acest lucru crește semnificația statistică a caracteristicilor și anomaliilor genetice găsite [10] .
Oamenii de știință de la Pacific Biosciences, împreună cu specialiști din alte organizații, au folosit această abordare pentru a fundamenta ipoteza unei duplicări în tandem activatoare a FLT3 ca țintă terapeutică în leucemia mielogenă acută [10] . Această tehnologie este, de asemenea, potrivită pentru analiza transcriptomului și splicing , deoarece o singură citire lungă de la un secvențior poate conține un ARNm întreg . Secvențierea în timp real cu o singură moleculă permite detectarea polimorfismelor cu un singur nucleotide cu o precizie ridicată [11] .
Cinetica reacției de polimerizare în timpul secvențierii face posibilă determinarea modificărilor cheie epigenetice ale ADN-ului . În secvențierea în timp real cu o singură moleculă, prezența nucleotidelor metilate este judecată de modificarea perioadei până la următoarea flash, deoarece metilarea afectează activitatea polimerazei. Această metodă este deja folosită pentru determinarea metiladeninei , metilcitozinei precum și a 5-hidroximetilcitozinei [12] [13] [14] . În 2012, un grup de oameni de știință a folosit această abordare pentru a analiza profilul complet de metilare a 6 bacterii [15] .
Folosind revers transcriptaza in loc de ADN polimeraza , tehnologia SMRT permite secventierea ARN . În acest fel, este posibilă detectarea simultană a secvenței, modificărilor bazei, permutărilor care afectează structura ARN. Cinetica transcripției inverse este, de asemenea, sensibilă la structura secundară a ARN-ului, ceea ce crește probabilitatea unor pauze lungi sau terminare în timpul reacției. Mai mult, secvențierea SMRT face posibilă detectarea dinamicii repliării ARN, de exemplu, în timpul transcripției inverse a retrovirusurilor sau în timpul degradării ARNm de către exozomi [16] .
Pacific Biosciences|Pacific Biosciences a comercializat secvențierea SMRT în 2011 [17] după ce a lansat o a doua configurație la sfârșitul anului 2010 [18] .
În aprilie 2013, compania a lansat o nouă versiune a secvențatorului numită „PacBio RS II”, care are un randament mai mare și permite citiri mai lungi de ADN [19] [20] .
Prototipul de cip SMRT conținea ~ 3000 de celule ZMW pentru secvențierea paralelă a ADN-ului. În 2012, au fost create celule SMRT, fiecare conținând aproximativ 150.000 de celule ZMW [21] .
Un nou set de reactivi lansat în 2012 a făcut posibilă creșterea lungimii citirii [22] . În acest moment, lungimea medie de citire este de aproximativ 40.000 bp. p., maxim - 100.000 n. n [23] .