Streptavidina / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / este o proteină de 66,0 kDa ( tetramer ) , purificată din bacteria Streptomyces avidinii . _ _ _ _ Homotetramerii de streptavidină au o afinitate extrem de mare pentru biotină (cunoscută și ca vitamina B 7 sau vitamina H). Cu o constantă de disociere (K d ) de ordinul ≈10 -14 mol/l [1]legarea biotinei de streptavidină este una dintre cele mai puternice interacțiuni non-covalente cunoscute în natură. Streptavidina este utilizată pe scară largă în biologia moleculară și bionanotehnologie datorită rezistenței complexului streptavidină-biotină la solvenți organici, denaturanți (de exemplu , clorură de guanidiniu ), detergenți (de exemplu , SDS , Triton X-100 ), enzime proteolitice și extreme de temperatură și pH.
Structura cristalină a streptavidinei legată de biotină a fost descrisă de două grupuri în 1989. Structura a fost rezolvată folosind difracția anormală cu mai multe lungimi de undă de către Hendrickson și colab. [2] la Universitatea Columbia și folosind substituția izomorfă multiplă de Weber și colab. [3] la EI DuPont Central Research and Development. În septembrie 2017, 171 de structuri au fost depuse la Banca de date de proteine . Consultați acest link pentru lista completă . Terminele N- și C-terminale ale proteinei cu rest 159 de lungime completă sunt procesate pentru a forma o streptavidină „miez” mai scurtă, constând în mod obișnuit din resturile 13-139; îndepărtarea N- și C-terminale este necesară pentru a obține cea mai mare afinitate de legare pentru biotină. Structura secundară a monomerului de streptavidină constă din opt catene β antiparalele care se pliază pentru a forma o structură terțiară β-baril antiparalelă. Locul de legare a biotinei este situat la un capăt al fiecărui butoi β. Patru monomeri identici de streptavidină (adică patru tulpini p identice) se leagă pentru a forma structura cuaternară tetramerică de streptavidină. Locul de legare a biotinei din fiecare tulpină constă din reziduuri din interiorul tulpinii împreună cu Trp120 conservat din subunitatea adiacentă. Astfel, fiecare subunitate contribuie la locul de legare al subunității vecine și, prin urmare, tetramerul poate fi considerat și ca un dimer al dimerilor funcționali.
Numeroase structuri cristaline ale complexului streptavidină-biotină au făcut lumină asupra originii acestei afinități remarcabile. În primul rând, există o complementaritate ridicată în formă între buzunarul de legare și biotină. În al doilea rând, există o rețea extinsă de legături de hidrogen formate cu biotina la locul de legare. Există opt legături de hidrogen direct la reziduuri la locul de legare (așa-numita „prima înveliș” a legăturilor de hidrogen), inclusiv reziduurile Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 și Asp128. Există, de asemenea, o „a doua înveliș” de legături de hidrogen, inclusiv reziduuri care interacționează cu primele reziduuri de înveliș. Cu toate acestea, afinitatea streptavidinei pentru biotină o depășește pe cea care ar fi prezisă numai din interacțiunile legăturilor de hidrogen, indicând un alt mecanism care contribuie la afinitatea ridicată [4] . Buzunarul de legare a biotinei este hidrofob și există numeroase contacte mediate de van der Waals și interacțiuni hidrofobe cu biotina atunci când se află în buzunar, ceea ce se crede că explică și afinitatea ridicată. În special, buzunarul este căptușit cu reziduuri de triptofan conservate. În cele din urmă, legarea biotinei este însoțită de stabilizarea unei bucle flexibile care leagă catenele β 3 și 4 (L3/4), care se închide peste biotina legată, acționând ca un „capac” peste buzunarul de legare și permițând eliberarea extrem de lentă a biotina. rata de disociere.
Cele mai multe încercări de mutare a streptavidinei au ca rezultat o scădere a afinității de legare a biotinei, ceea ce este de așteptat într-un astfel de sistem optimizat. Cu toate acestea, s-a descoperit că un mutant de streptavidină nou creat, numit traptavidin, disociază biotina de mai mult de zece ori mai lent, în plus față de o stabilitate termică și mecanică mai mare [5] . Această scădere a ratei de disociere a fost însoțită de o scădere de două ori a ratei de asociere.
Afinitatea de legare a biotinei poate fi perturbată prin marcarea chimică a streptavidinei, cum ar fi fluoroforii amino-reactivi ; flavidina este un mutant de streptavidină fără catene laterale de lizină care păstrează caracteristici bune de legare a biotinei după ce a fost marcat cu un colorant fluorescent atunci când colorantul este cuplat la capătul amino [6] .
Printre cele mai comune utilizări ale streptavidinei se numără purificarea sau detectarea diferitelor biomolecule. Interacțiunea puternică a streptavidinei și a biotinei poate fi utilizată pentru a atașa diferite biomolecule între ele sau pe un suport solid. Sunt necesare condiții stricte pentru a perturba interacțiunea streptavidină-biotină, care adesea denaturează proteina de interes care este purificată. Totuși, s-a demonstrat că o scurtă incubare în apă peste 70°C va perturba reversibil interacțiunea (cel puțin pentru ADN-ul biotinilat) fără denaturarea streptavidinei, permițând reutilizarea suportului solid de streptavidină [7] . O altă aplicație a streptavidinei este purificarea și detectarea proteinelor modificate genetic cu peptida Strep-tag . Streptavidina este utilizată pe scară largă în Western blotting și imunotestele conjugate cu unele molecule reporter, cum ar fi peroxidaza de hrean . Streptavidina a fost, de asemenea, utilizată în domeniul emergent al nanobiotehnologiei , folosind molecule biologice precum proteinele sau lipidele pentru a crea dispozitive/structuri la scară nanometrică . În acest context, streptavidina poate fi folosită ca element de bază pentru legarea moleculelor de ADN biotinilat pentru a crea schele din nanotuburi de carbon cu un singur perete [8] sau chiar poliedre complexe de ADN [9] . Streptavidina tetramerică a fost folosită și ca centru în jurul căruia alte proteine pot fi poziționate fie printr-o etichetă de afinitate, cum ar fi Strep-tag sau AviTag , fie prin fuziune genetică cu SpyTag [10] . Fuziunea cu SpyTag a permis crearea de ansambluri cu 8 sau 20 de subunități de streptavidină. Odată cu sonda de forță moleculară pentru studiile de microscopie a forței atomice [11] , au fost create și noi materiale, cum ar fi rețelele cristaline tridimensionale [12] . Streptavidina are un punct izoelectric (pI) slab acid de ~5, dar o formă recombinată de streptavidină cu un pI aproape neutru este de asemenea disponibilă comercial.
Imunoterapie pre-țintităImunoterapia pre-țintită folosește streptavidină conjugată la un anticorp monoclonal împotriva antigenelor specifice cancerului, urmată de injectarea de biotină radiomarcată pentru a furniza radiații numai celulei canceroase. Obstacolele inițiale includ saturarea situsurilor de legare a biotinei de pe streptavidină cu biotină endogenă în loc de biotina marcată radioactiv administrată și un grad ridicat de expunere radioactivă la rinichi datorită proprietăților puternice de adsorbție ale streptavidinei asupra celulelor. Acest nivel ridicat de legare la tipurile de celule aderente, cum ar fi trombocitele activate și melanoamele, este acum considerat că rezultă din legarea integrinei mediată de secvența RYD din streptavidină [13] .
Streptavidina este un tetramer și fiecare subunitate leagă biotina cu aceeași afinitate. Multivalența este un avantaj în aplicații precum colorarea cu tetramer MHC , unde efectele avidității îmbunătățesc capacitatea moleculelor MHC atașate la streptavidină de a detecta celule T specifice [14] . În alte cazuri, cum ar fi utilizarea streptavidinei pentru a vizualiza proteine specifice pe celule, polivalența poate afecta funcția proteinei de interes. Streptavidina monovalentă este o formă recombinată a streptavidinei, care este un tetramer, dar numai unul dintre cele patru situsuri de legare este funcțional. Acest site unic de legare are o afinitate de 10-14 mol /l și nu poate provoca reticulare [15] . Aplicațiile streptavidinei monovalente au inclus urmărirea prin fluorescență a receptorilor de suprafață celulară , decorarea ADN-ului origami și acționând ca un indicator pentru a identifica zone specifice pentru microscopia crioelectronică .
Streptavidina monomerică este o formă recombinată de streptavidină cu mutații pentru a scinda tetramerul în monomer și pentru a crește solubilitatea subunității izolate rezultate. Versiunile monomerice ale streptavidinei au o afinitate pentru biotină de 10 −7 mol/l 10 −8 mol/l și, prin urmare, nu sunt ideale pentru etichetare, dar sunt utile pentru purificare acolo unde se dorește reversibilitatea [16] [17] .
DivalentStreptavidina cu exact două situsuri de legare a biotinei per tetramer poate fi preparată prin amestecarea subunităților cu și fără un situs funcțional de legare a biotinei și purificarea prin cromatografie cu schimb ionic . Siturile de legare funcționale au aici aceeași stabilitate de legare a biotinei ca și streptavidina de tip sălbatic. Streptavidina bivalentă cu două situsuri de legare a biotinei împreună (cis-bivalent) sau separat (trans-bivalent) poate fi purificată separat [18] .
TrivalentStreptavidina cu exact trei situsuri de legare a biotinei per tetramer poate fi, de asemenea, preparată folosind același principiu ca și pentru streptavidinele bivalente [19] .
Streptavidine cu valență ridicatăStreptavidinele cu valență mai mare au fost generate utilizând chimia de conjugare a legăturilor izopeptidice folosind tehnologia SpyTag/SpyCatcher [20] . Acest lucru sugerează un tetramer de streptavidină cu trei situsuri de legare a biotinei și streptavidină moartă fuzionată fie cu SpyTag, fie cu SpyCatcher. Când diferiți tetrameri sunt amestecați împreună, se formează o legătură covalentă care oferă mai multe locuri de legare a biotinei. Cu această metodă, au fost create șase și douăsprezece site-uri de legare a biotinei per moleculă.
Streptavidina nu este singura proteină care poate lega biotina cu afinitate mare. Avidina este cealaltă proteină cea mai cunoscută care leagă biotina. Izolată inițial din gălbenușul de ou, avidina are doar 30% identitate de secvență cu streptavidina, dar structură secundară, terțiară și cuaternară aproape identică. Avidina are o afinitate mai mare pentru biotină ( Kd ~ 10–15 M ), dar spre deosebire de streptavidină, avidina este glicozilată, încărcată pozitiv și are activitate pseudocatalitică (avidina poate îmbunătăți hidroliza alcalină a legăturii esterice dintre biotină și nitrofenil). grup) și are o tendință mai mare de agregare. Pe de altă parte, streptavidina este cel mai bun liant pentru conjugatul de biotină; avidina are o afinitate de legare mai mică decât streptavidina atunci când biotina este conjugată cu o altă moleculă, în ciuda faptului că avidina are o afinitate mai mare pentru biotina liberă, neconjugată. Deoarece streptavidina nu are nicio modificare a carbohidraților și are un pI aproape neutru , are avantajul unei legături nespecifice mult mai scăzute decât avidina. Avidina deglicozilata (NeutrAvidin) este mai comparabilă ca mărime, pI și legarea nespecifică la streptavidină.
Grupuri care cercetează și dezvoltă proteinele familiei streptavidinei sau avidinei (în ordine alfabetică)