Amprenta ADN-ului

Amprenta ADN-ului este o  metodă de căutare în structura ADN -ului pentru secvențe de legare ale proteinelor care leagă ADN-ul . Această metodă este utilizată pentru a studia interacțiunea proteinelor cu ADN atât in vitro (cu complexe ADN-proteină izolate din celule), cât și in vivo (în condiții fiziologice , în interiorul celulei).

De exemplu, factorii de transcripție se leagă de promotori , amplificatori sau amortizoare și reglează expresia genelor individuale în genom . Metoda de amprentare a ADN-ului permite stabilirea secvențelor de ADN de care se leagă aceste proteine ​​de reglare. Metoda este, de asemenea, potrivită pentru o căutare rapidă ( screening ) pentru proteine ​​specifice care se leagă la o anumită secvență de ADN.

Metoda și-a luat numele de la cuvântul englezesc „footprint”, care desemnează o amprentă sau amprentă. [1] .

Istorie

În 1978, David Galas și Albert Schmitz au dezvoltat o tehnică de amprentă ADN pentru a studia specificitatea de legare a unei proteine ​​represoare la operonul de lactoză . Metoda footprinting s-a bazat pe metoda de secvențiere Maxam-Gilbert. [2]

Metoda

Cea mai simplă aplicare a acestei metode este de a determina dacă o proteină se leagă de o anumită regiune a ADN-ului. [3]

1. Folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR), secvența de ADN dorită este amplificată și marcată, care este locul probabil de legare a proteinei. Dimensiunea ideală a ampliconului în acest caz este între 50 și 200 de baze .
2. Se adaugă proteina de interes, în timp ce o parte din ADN este lăsată intactă pentru comparare ulterioară.
3. Se adaugă un agent de tăiere - de natură chimică sau enzimatică . Agentul de tăiere introduce aleatoriu rupturi în ADN. Condițiile de reacție sunt alese astfel încât fiecare catenă de ADN să fie tăiată într-un singur loc. O proteină care se leagă în mod specific la o secvență de nucleotide ADN protejează locul de legare împotriva tăierii.
4. Produșii de degradare a ADN-ului sunt separați prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă . Fragmentele de ADN care nu au fost legate de o proteină vor fi tăiate în locuri aleatorii și vor fi distribuite în gel sub forma unei „scări”. Fragmentele de ADN de care se leagă proteina vor fi protejate de tăiere și vor forma o amprentă, o urmă ( amprenta engleză  ) pe o astfel de „scăriță”. Simultan cu amprenta, secvențierea ADN-ului poate fi realizată prin metoda Maxam-Gilbert și se va stabili secvența de nucleotide cu care se leagă proteina corespunzătoare.

Etichetare

Moleculele de ADN analizate pentru a determina locația situsului de legare a proteinei pot fi marcate separat de capătul 3’ și de capătul 5’. Se folosesc etichete:

• Etichetele radioactive sunt folosite în mod tradițional pentru a marca fragmentele de ADN pentru amprenta la sol, această metodă de etichetare a fost dezvoltată pe metodele de secvențiere a ADN-ului conform lui Maxam-Gilbert . Această variantă este foarte sensibilă; cantități mici de ADN pot fi vizualizate cu o etichetă radioactivă.
• Etichetele fluorescente sunt un substitut pentru radioactive periculoase. Cu toate acestea, etichetarea fluorescentă este mai puțin sensibilă pentru imagistica ADN și nu pot fi detectate concentrații scăzute de produse de amprentă. Gelurile de secvențiere și tehnicile de electroforeză capilară sunt utilizate pentru a vizualiza produsele marcate cu fluorofori . [3]

Agent de tăiere

Ca agent de tăiere pentru degradarea ADN-ului studiat se utilizează DNaza de tip I [3] [4] , reactivul Fenton [5] , iradierea ultravioletă [6] .

Note

1. ↑ Biologia moleculară a celulei. M.: Mir, 1994.
2. ↑ Galas D și Schmitz A. (1978) DNAse footprinting: a simple method for the detecting of protein-ADN binding specificity. Cercetarea acizilor nucleici. 5(9):3157-70.
3. ↑ 1 2 3 Hampshire A, Rusling D, Broughton-Head V și Fox K. (2007) Footprinting: A method for determining the secvence selectivity, afinity and kinetics of DNA-binding liganzis. metode. 42:128-140.
4. ↑ LeBlanc B și Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Metode în Biologie Moleculară. 148:31-8.
5. ↑ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L și Heumann H. (2001) Hydroxyl radical footprinting. Metode în Biologie Moleculară. 148:49-61.
6. ↑ Geiselmann J și Boccard F. (2001) Ultraviolet-laser footprinting. Metode în Biologie Moleculară. 148:161-73.