Secvențierea

Versiunea actuală a paginii nu a fost încă examinată de colaboratori experimentați și poate diferi semnificativ de versiunea revizuită pe 26 mai 2021; verificările necesită 2 modificări .

Secvențierea biopolimerilor ( proteine ​​și acizi nucleici  - ADN și ARN ) - determinarea secvenței lor de aminoacizi sau nucleotide (din latină  sequentum  - secvență). Ca rezultat al secvențierii, se obține o descriere formală a structurii primare a unei macromolecule liniare sub forma unei secvențe de monomeri sub formă de text. Dimensiunile segmentelor de ADN care urmează să fie secvențiate nu depășesc de obicei 100 de perechi de baze (secvențierea de generația următoare) și 1000 de perechi de baze pentru secvențierea Sanger. Ca rezultat al secvențierii secțiunilor de ADN care se suprapun, se obțin secvențe de secțiuni de gene, gene întregi, ARNm total sau genomi complete ale organismelor [1] [2] .

Pentru secvențiere se folosesc metodele lui Edman , Sanger și alții; în prezent, metoda Sanger cu trifosfați dideoxinucleozidici ( ddNTP ) este utilizată în mod obișnuit pentru secvențierea genelor. De obicei, înainte de secvențiere, secțiunea de ADN care urmează să fie secvențiată este amplificată folosind PCR . Secvențierea întregului genom este de obicei efectuată folosind tehnologii de secvențiere de ultimă generație .

Secvențierea Sanger

Metoda dideoxinucleotidelor, sau metoda „terminării lanțului”, a fost dezvoltată de F. Sanger în 1977 și este utilizată în prezent pe scară largă pentru a determina secvența de nucleotide a ADN-ului. Secvențierea Sanger hibridizează o oligonucleotidă sintetică de 17–20 nt lungime cu un situs specific într-unul dintre lanțurile situsului secvențial. Această oligonucleotidă este un primer care furnizează o grupare 3'-hidroxil pentru a iniţia sinteza unui lanţ complementar matriţei.

Soluția de primer este împărțită în patru tuburi, fiecare conținând patru deoxinucleotide, dATP, dCTP, dGTP și dTTP (dintre care unul este marcat radioactiv) și una dintre cele patru 2',3'-dideoxinucleotide (ddATP, ddTTP, ddGTP sau ddCTP) . Dideoxinucleotida este inclusă în toate pozițiile din amestecul de lanțuri în creștere, iar după atașarea acesteia, creșterea lanțului se oprește imediat.

Ca rezultat, în fiecare dintre cele patru eprubete, cu participarea ADN polimerazei , se formează un set unic de oligonucleotide de lungimi diferite, inclusiv secvența primerului. În plus, formamidă este adăugată în eprubete pentru a separa lanțurile și electroforeza este efectuată într-un gel de poliacrilamidă pe patru benzi. Efectuați autoradiografie , care vă permite să „citiți” secvența de nucleotide a segmentului de ADN secvențial.

Într-o versiune mai modernă, dideoxinucleotidele sunt marcate cu patru coloranți fluorescenți diferiți și PCR este efectuată într-un tub. Apoi, în timpul electroforezei pe gel de poliacrilamidă, un fascicul laser la un anumit punct al gelului excită fluorescența coloranților, iar detectorul determină ce nucleotidă migrează în prezent prin gel. Instrumentele moderne folosesc electroforeza capilară pentru secvențierea ADN-ului . [3]

Secvențiere de înaltă eficiență

Vezi și

Note

  1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molecular biology of the cell: in three volumes. - 2. - Moscova: Mir, 1994. - T. 1. - 517 p. — 10.000 de exemplare.  — ISBN 5030019855 .
  2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biological chemistry. - 3. - Moscova: Şcoala superioară, 2000. - 479 p. - 7000 de exemplare.  — ISBN 5060037207 .
  3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principii și aplicare. - Moscova: Mir, 2002. - 589 p. — ISBN 5030033289 .

Literatură

Link -uri

  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii
 Medicina personalizata
Secțiuni de date Omix
Secțiuni de aplicație
Metode
Articole similare