Biblioteca genomică

O bibliotecă genomică este o colecție de ADN din întregul genom al unui singur organism. Acest ADN este stocat într-o populație de vectori identici , fiecare conținând o inserție diferită de ADN.

Crearea unei biblioteci genomice

Pentru a construi o bibliotecă genomică, ADN-ul este extras din celule și apoi digerat cu o enzimă de restricție pentru a tăia ADN-ul în fragmente de o anumită dimensiune [1] [2] . Fragmentele sunt apoi inserate într-un vector folosind enzima ADN ligază . Mai mult, vectorul ADN poate fi inserat în organismul gazdă - de obicei în populația de Escherichia coli ( E. coli ) sau drojdie , unde fiecare celulă conține copii ale vectorului cu o inserție unică.

Stocare și aplicații

Utilizarea celulei gazdă pentru a stoca vectorul permite amplificarea și identificarea ușoară a clonelor specifice din bibliotecă pentru analiză. Biblioteca genomică poate fi stocată pentru o perioadă lungă de timp (înghețată). Dacă este necesar, clone bacteriene individuale sau de drojdie care conțin fragmente de ADN cu genele dorite sau alte elemente ale genomului sunt izolate și propagate ( donate ). Părți ale genomului clonat în acest mod sunt izolate din celule și utilizate pentru a rezolva diverse probleme teoretice și practice de genetică , medicină (inclusiv diagnosticul bolilor ereditare ) și biotehnologie , precum și pentru cartografierea genomului [3] [4] [5 ]. ] .

Screeningul (dinengleză screening) a bibliotecii, adică căutarea unui fragment de ADN specific printre sute și mii de alte secvențe, se realizează prin metodahibridizăriifolosindsonde ADN [3] . Dacă cercetătorul cunoaște cel puțin o mică secvență denucleotidede la locul dorit, elsintetizează secvențăcomplementarăprimerde aproximativ 20 de nucleotide lungime) și o etichetează fie cuizotop radioactivfieetichetăfluorescentăSe realizează oreplicăvas Petricucoloniiprinblottingnitrocelulozăsau altă membrană, pe care rămâne amprenta tuturor coloniilor. După aceea, se efectuează distrugerea celulelor bacteriene de pe amprentă, eliberarea ADN-ului dinproteine​​într-alcalinși denaturarea ADN-ului într-o moleculă monocatenar. Apoi, toate coloniile sunt tratate cu o sondă și se uită la care dintre colonii s-a alăturat sonda conform principiului complementarității. Această colonie va conține fragmentul de ADN dorit.

Uneori, cercetătorul nu știe secvența de ADN pe care o caută, dar are secvența de aminoacizi a proteinei studiate. Deoarece mai multe triplete de nucleotide (de la unu la șase) pot corespunde fiecărui aminoacid , ADN-urile probabile de codificare pot fi diferite. Se prepară apoi un amestec de sonde care poate recunoaște secvența presupusă.

Metodele moderne de înaltă tehnologie pentru screeningul bibliotecilor genomice (în special cele realizate folosind LHC - vectori ) se bazează pe utilizarea producției robotizate (automatizate) , în orice număr necesar de copii, microplăci pentru stocarea coloniilor (clone), precum și membrane de nitroceluloză și nailon (filtre) utilizate direct pentru hibridizarea cu sonde ADN. O creștere suplimentară a eficienței screening-ului este realizată prin utilizarea așa-numitelor sonde overgos (din engleză  over lapping oli gos  - „overlapping oligonucleotides ”) ca sonde ADN [3] [6] . De asemenea, este posibil să utilizați PCR pentru a ecraniza bibliotecile.

Un alt tip de bibliotecă genomică este biblioteca de microsateliți , ale cărei clone conțin repetiții în tandem . Secvențierea lor face posibilă obținerea de markeri ADN polimorfi ( loci microsateliți ) pentru diverse aplicații genetice și genomice [7] .

Vezi și

Note

  1. ↑ Lee M.-K., Ren CW, Yan B., Cox B., Zhang H.-B., Romanov MN, Sizemore FG, Suchyta SP, Peters E., Dodgson JB Construcția și caracterizarea a trei biblioteci BAC pentru analiză a genomului de pui  (ing.)  // Animal Genetics  : journal. - Oxford , Marea Britanie : Societatea Internațională de Genetică Animală; Blackwell Publishers Ltd , 2003. Voi. 34, nr. 2 . - P. 151-152. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1046/j.1365-2052.2003.00965_5.x . — PMID 12648103 . Arhivat din original pe 22 februarie 2015.  (Accesat: 22 februarie 2015)
  2. ↑ Sazanov A. A., Romanov M. N., Smirnov A. F. Libraries of extended genomic clones as a tool for molecular cytogenetic analysis of the aviar genome  // Genetics  : journal. - M . : Nauka , 2005. - T. 41 , nr 5 . - S. 581-589 . — ISSN 0016-6758 . — PMID 15977807 . Arhivat din original pe 17 martie 2015.  (Accesat: 17 martie 2015)
  3. ↑ 1 2 3 Song B.-K., Nadarajah K., Romanov MN Ratnam W. Screening-ul bibliotecii de cromozomi artificiali bacterieni încrucișați (BAC) prin hibridizare bazată pe overgo și maparea BAC-contig a unui locus de trăsătură cantitativă de îmbunătățire a randamentului (QTL) ) yld1.1 în orezul sălbatic din Malaezia Oryza rufipogon  (engleză)  // Cellular & Molecular Biology Letters : journal. — Wrocław , Polonia ; Berlin , Heidelberg , Germania : Scrisori de biologie celulară și moleculară, Universitatea din Wrocław , Ministerul Științei și Învățământului Superior, Polonia ; Springer Science+Business Media , 2005. Vol. 10, nr. 3 . - P. 425-437. — ISSN 1425-8153 . — PMID 16217554 . Arhivat din original pe 15 martie 2015.  (Accesat: 15 martie 2015)
  4. ↑ Romanov MN, Koriabine M., Nefedov M., de Jong PJ, Ryder OA Construcția unei biblioteci BAC de condor din California și a unei hărți fizice comparative de pui-condor de prima generație ca  resursă de genomică pentru conservarea speciilor pe cale de dispariție //  Genomica  : log . - Amsterdam , Țările de Jos : Academic Press Inc , Elsevier Science BV , 2006. - Vol. 88, nr. 6 . - P. 711-718. — ISSN 0888-7543 . - doi : 10.1016/j.ygeno.2006.06.005 . — PMID 16884891 . Arhivat din original pe 18 februarie 2015.  (Accesat: 18 februarie 2015)
  5. ↑ Romanov MN, Dodgson JB, Gonser RA, Tuttle EM Cartografierea comparativă bazată pe BAC în vrabia cu gât alb, un model nou de genomică comportamentală, folosind hibridizarea depășită între specii  // BMC Research Notes  : journal  . - Londra , Marea Britanie: BioMed Central Ltd , 2011. - Vol. 4. - P. 211. - ISSN 1756-0500 . - doi : 10.1186/1756-0500-4-211 . — PMID 21693052 . Arhivat din original pe 2 martie 2015.  (Accesat: 2 martie 2015)
  6. ↑ Romanov MN , Dodgson JB Încrucișarea speciilor depășește hibridizarea și cartografierea fizică comparativă în genomurile aviare  //  Animal Genetics: journal. — Oxford, Marea Britanie: Societatea Internațională de Genetică Animală; Blackwell Publishers Ltd, 2006. - Vol. 37, nr. 4 . - P. 397-399. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2006.01463.x . — PMID 16879356 . Arhivat din original pe 15 februarie 2015.  (Accesat: 15 februarie 2015)
  7. ↑ Romanov MN , Jones KC , Chemnick LG , Stremel -Mork E. , Otten C. , Da Y. , Akhunov ED , Ryder OA (2009-01-10). Biblioteca îmbogățită cu microsateliți condor din California ca instrument pentru studii genetice și genomice la o specie pe cale de dispariție . Conferința internațională a XVII-lea genomului vegetal și animal, San Diego, 10-14 ianuarie 2009 . San Diego , CA , SUA : Scherago International. p. 107 Rezumat P517 . Accesat 2009-01-10 . Arhivat pe 23 ianuarie 2012 la Wayback Machine 

Literatură