Reacția în lanț a polimerazei imbricate

Reacția în lanț a polimerazei imbricate ( în engleză  nested PCR  - „nested” PCR) este o variație în două etape a PCR utilizată pentru a reduce cantitatea de produși de reacție nespecifici [1] . În prima etapă , o regiune este amplificată , care include fragmentul de ADN țintă și secvențele sale de flancare (adică situate la marginile fragmentului), la care prima pereche de primeri este recoaptă . În a doua etapă, se adaugă primeri care sunt complementari capetelor fragmentului țintă. Deoarece produsul primei etape conține fragmentul țintă (adică produsul final în interiorul produsului primei etape), această variație PCR se numește imbricată [1] .

Reacția în lanț a polimerazei

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este un proces de amplificare a ADN-ului care utilizează enzima ADN polimerază dependentă de ADN . O astfel de reacție și-a găsit o aplicație largă în laboratoarele genetice pentru a detecta prezența unei anumite secțiuni de ADN sau ARN în probe (în al doilea caz, este necesar să se transforme mai întâi ARN-ul în ADN printr-o reacție de transcripție inversă ). De asemenea, PCR este utilizată în inginerie genetică pentru a obține fragmentul necesar și utilizarea ulterioară a acestuia în clonare , transcriere in vitro și în alte scopuri. Un pas important în pregătirea reacției este alegerea primerilor care urmează să fie recoapți la capetele fragmentului țintă. În acest caz, primerii se recoacă adesea și la alte regiuni ADN, rezultând un amestec de produse. Probabilitatea ca acest lucru să se întâmple crește odată cu numărul de cicluri PCR [1] .

Primări

PCR imbricată utilizează două perechi de primeri adăugați în două etape de reacție consecutive. Prima pereche se numește externă și servește pentru amplificarea inițială a situsului, care include fragmentul de ADN țintă, în timp ce în această etapă se utilizează un număr mic de cicluri de temperatură (de la 15 la 30). A doua pereche, numită internă, este recoaptă la produsul primei și este utilizată în a doua etapă a PCR cu un număr mare de cicluri de temperatură. Deoarece cantitatea de ADN care conține fragmentul țintă crește exponențial după prima etapă , iar primerii utilizați în fiecare etapă sunt complementari cu diferite secvențe din jurul regiunii ADN țintă, specificitatea rezultată a reacției crește. Această abordare este adesea folosită pentru a obține fragmente rare sau regiuni de complexitate scăzută (de exemplu, secvențe bogate în GC ) [2] .

Etape de reacție și protocol

Protocolul PCR imbricat a fost descris pentru prima dată în 1993 de Kamolvarin și colegii săi pentru diagnosticul rabiei [3] . De atunci, succesiunea acțiunilor a rămas practic neschimbată [4] . Protocolul original din articol este descris mai jos.

Prima etapă

După izolarea ARN, transcripția inversă a fost efectuată folosind 50 pmol din fiecare pereche de primeri externi pentru 1 μg de material. Amestecul care conține fuziunea ARN/ cADN și primeri a fost apoi adus până la 50 pl cu un tampon PCR care conține 1,25 U. Taq-ADN polimerază și 62,5 µmol/l dDNP ( dezoxiribonucleozid trifosfat ). 50 µl de ulei mineral au fost stratificați deasupra amestecului și s-au efectuat 30 de cicluri PCR (94°C, 1 min (topire); 45°C, 2 min (recoace); 72°C, 2,5 min (alungire)) [ 3] .

În prima etapă, o pereche exterioară de primeri complementare regiunilor din jurul fragmentului de ADN țintă este utilizată pentru a amplifica acest fragment. Pe lângă locul țintă, primerii se pot recoa și pe alte site-uri. Amestecul final de produse din prima etapă include atât ADN țintă, cât și impurități [3] .

Etapa a doua

Pentru a doua etapă a PCR imbricată, o alicotă de 2 ui a fost luată din primul amestec și adăugată la 23 ui dintr-un amestec care conține 20 pmol de primeri interni complementari regiunilor fragmentului țintă însuși, 25 mmol/l de dDNF și 1 unitate de ADN polimerază Taq. A petrecut 30 de cicluri de amplificare cu același program ca în prima etapă [3] .

În acest caz, probabilitatea de recoacere a primerului cu alți produși din prima etapă este extrem de scăzută, iar în majoritatea cazurilor doar fragmentul de ADN țintă este amplificat [2] [3] .

Exemple de utilizare

PCR imbricat este utilizat pe scară largă în sarcini care necesită o specificitate ridicată, cum ar fi: sisteme de testare [5] , lucru cu cantități mici de material [6] , purificarea probelor de ADN pentru analize și utilizare ulterioară [7] .

Cazuri de utilizare specifice pentru PCR imbricate:

Note

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplificarea acizilor nucleici  (engleză)  // Diagnostic Molecular Biology. - 2019. - P. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. PCR cantitativă îmbunătățită folosind primeri imbricați.  (engleză)  // Cercetarea genomului. - 1994. - 1 iunie ( vol. 3 , nr. 6 ). - P. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Diagnostic of Rabies by Polymerase Chain Reaction with Nested Primers  //  Journal of Infectious Diseas. - 1993. - 1 ianuarie ( vol. 167 , nr. 1 ). - P. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principii și aspecte tehnice ale amplificării PCR . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 resursă online (325 pagini) p. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Abordare nouă bazată pe PCR cu un singur tub și o bandă de flux lateral pentru diagnosticul extrem de sensibil al meningitei tuberculoase  //  PLOS ONE. - 2017. - 30 octombrie ( vol. 12 , nr. 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Utilitatea unei reacții în lanț cu polimerază imbricată pentru diagnosticul molecular al virusului limfotrop cu celule T umane de tip I/II  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - iunie ( vol. 99 , nr. 4 ). - P. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-Cell Receptor and Antibody Cell Biblioteci ADNc pentru profilarea secvențierii profunde de următoarea generație  //  Frontiere în imunologie. - 2013. - Vol. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ^ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Dezvoltarea unei proceduri de PCR imbricate foarte sensibile folosind un singur tub închis pentru detectarea materialului vegetal asimptomatic Erwinia amylovorain //  Microbiologie aplicată și de mediu. - 2000. - 1 mai ( vol. 66 , nr. 5 ). - P. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .  
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Dezvoltarea unui test PCR imbricat pentru detectarea rapidă a Pilidiella granati în fructele de rodie  //  Rapoarte științifice. - 2017. - 20 ianuarie ( vol. 7 , nr. 1 ). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Proiectarea și evaluarea primerilor PCR imbricați pentru detectarea specifică a norovirusurilor genogrupului I în stridii  //  Sonde moleculare și celulare. - 2018. - august ( vol. 40 ). - P. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Utilizarea PCR imbricată pentru detectarea trichomonadelor în lichidul de lavaj bronhoalveolar  (engleză)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10 iunie ( vol. 19 , nr. 1 ). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Accesați articolul Wikidata  Dicționare și enciclopedii