Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC, engleză HPLC , Cromatografia lichidă de înaltă performanță ) este una dintre metodele eficiente de separare a amestecurilor complexe de substanțe , utilizată pe scară largă atât în chimia analitică , cât și în tehnologia chimică . Baza separării cromatografice este participarea componentelor amestecului care sunt separate într-un sistem complex de interacțiuni van der Waals (în principal intermoleculare ).) la interfață. Ca metodă de analiză, HPLC face parte dintr-un grup de metode care, datorită complexității obiectelor studiate, include separarea preliminară a amestecului complex inițial în unele relativ simple. Amestecurile simple obţinute sunt apoi analizate prin metode fizico -chimice convenţionale sau prin metode speciale dezvoltate pentru cromatografie .
Principiul cromatografiei lichide este de a separa componentele unui amestec pe baza diferenței de distribuție de echilibru între două faze nemiscibile, dintre care una staționară și cealaltă mobilă ( eluent ).
O caracteristică distinctivă a HPLC este utilizarea de înaltă presiune (până la 400 bar ) și adsorbanți cu granulație fină (de obicei 3–5 µm , acum până la 1,8 µm). Acest lucru face posibilă separarea rapidă și completă a amestecurilor complexe de substanțe (timpul mediu de analiză este de la 3 la 30 de minute ).
Metoda HPLC este utilizată pe scară largă în domenii precum chimie , petrochimie , biologie , biotehnologie , medicină , prelucrarea alimentelor , protecția mediului , producția de medicamente și multe altele.
Conform mecanismului de separare a substanțelor analizate sau separate, HPLC este împărțită în adsorbție , distribuție , schimb ionic , excludere , schimb ligand și altele.
Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-un singur mecanism, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea excluderii poate fi complicată de efectele de adsorbție, de adsorbție – distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele din probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare , bazicitate sau aciditate , în ceea ce privește greutatea moleculară , polarizabilitatea și alți parametri, cu atât este mai probabil să apară un mecanism diferit de separare pentru astfel de substanțe.
Faza staționară este mai polară decât faza mobilă, astfel încât solventul nepolar predomină în compoziția eluentului:
Vezi și Cromatografia în fază inversă
HPLC cu fază inversă ( RP-HPLC din fază inversă - fază inversă) este realizată utilizând o fază staționară nepolară și solvenți polari (apoși) . Faza staţionară este silicagel convenţional care a fost modificat la suprafaţă cu RMe2SiCI , unde R este o grupare alchil cu catenă liniară, cum ar fi C18H37 sau C8H17 . În consecință, se disting coloanele cu material RP-18 și/sau RP-8. Cu faze staționare similare, timpii de retenție sunt mai mari pentru moleculele mai puțin polare , în timp ce moleculele polare eluează mai repede (mai devreme în HPLC analitic). Este posibil să se mărească timpul de retenție prin adăugarea de mai multă apă la faza mobilă, făcând astfel afinitatea analitului hidrofob pentru faza staționară hidrofobă mai puternică, în raport cu faza mobilă acum mai hidrofilă. În mod similar, este posibil să se reducă timpul de retenție prin adăugarea mai multor solvent organic la eluent (fază mobilă). HPLC cu fază inversă este utilizat atât de des încât este adesea descris incorect ca simplu HPLC fără nicio notație suplimentară. În farmacie, HPLC în fază inversă este utilizată ca metodă obligatorie pentru analizarea medicamentelor înainte ca acestea să fie eliberate.
RP-HPLC funcționează pe principiul interacțiunilor hidrofobe care apar datorită simetriei mari în structura dipolului moleculei de apă și joacă cel mai important rol în toate procesele din științele vieții. RP-HPLC măsoară aceste forțe de interacțiune. Legarea analitului de faza staționară (staționară) este proporțională cu suprafața de contact din jurul segmentului nepolar al moleculei analitului cu ligandul de fază staționară. Acest efect solvofob este dominat de puterea apei de a „reduce cavitățile” din jurul analitului și al lanțului C18 în comparație cu complexul ambelor. Energia eliberată în acest fel este proporțională cu tensiunea superficială a eluentului (apă: 7,3×10−6 J/cm², metanol: 2,2×10−6 J/cm²) și suprafața hidrofobă a analitului și respectiv ligandului. Retenția substanței în coloană poate fi redusă prin adăugarea unui solvent mai puțin polar (metanol, acetonitril) în faza mobilă pentru a reduce tensiunea superficială a apei. Gradientul de solvent exploatează acest efect reducând automat polaritatea și tensiunea superficială a fazei mobile apoase în timpul analizei.
Proprietățile structurale ale moleculei de analit joacă un rol important în caracteristicile reținerii acestuia în faza staționară. În general, un analit cu o porțiune hidrofobă mare (C-H, C-C și, de obicei, legături atomice nepolare, cum ar fi SS și altele) este reținut mai mult timp deoarece nu interacționează cu suprafața apei. Pe de altă parte, analiții cu porțiuni polare mari în structura lor (având grupări polare cum ar fi -OH, -NH2 , COO - sau -NH3 + în structura lor ) sunt reținuți mai puțin deoarece se leagă mai bine de apă. Astfel de interacțiuni pot fi supuse efectelor sterice: moleculele foarte mari nu pot avea decât acces limitat la porii fazei staționare, unde au loc interacțiuni cu liganzii de suprafață (lanțuri alchil). O astfel de obstrucție a suprafeței are ca rezultat, în general, o retenție redusă.
Timpul de retenție crește odată cu creșterea suprafeței hidrofobe (nepolare). Compușii cu lanț ramificat sunt spălați mult mai repede decât izomerii lor liniari corespunzători, deoarece suprafața totală este redusă. Compușii organici similari cu legături simple C-C sunt spălați mai târziu decât compușii similari cu legături C=C sau legături triple C-C, deoarece legăturile duble sau triple sunt mai scurte decât o singură legătură C-C.
Indiferent de tensiunea superficială a fazei mobile (rezistența de organizare în structura eluentului), alte caracteristici ale fazei mobile pot afecta timpul de retenție al analitului. De exemplu, adăugarea de săruri anorganice determină o creștere liniară moderată a tensiunii superficiale a soluțiilor apoase (aproximativ 1,5⋅10 −7 J/cm² per Mol pentru NaCl, 2,5⋅10 −7 J/cm² per Mol pentru (NH 4 ). ) 2 SO 4 ) și prin urmare Deoarece entropia unei soluții de analit este controlată de tensiunea superficială, adăugarea de săruri are ca rezultat o creștere a timpului de retenție. O tehnică similară este utilizată pentru a separa fără probleme și a recupera proteinele și pentru a proteja activitatea lor biologică în analiza proteinelor (o tehnică numită cromatografie de interacțiune hidrofobă, HIC).
Un alt factor important este pH -ul fazei mobile, deoarece poate modifica caracterul hidrofob al analitului. Pentru a face acest lucru, multe metode folosesc un agent de tamponare, cum ar fi fosfatul de sodiu , pentru a controla pH-ul. Soluțiile tampon servesc mai multor scopuri: controlează pH-ul, neutralizează sarcina fazei staționare de pe suprafața gelului de silice și acționează ca agenți de împerechere ionică pentru a neutraliza sarcina analitului. Formiatul de amoniu este adesea folosit în spectrometria de masă pentru a îmbunătăți detectarea anumitor analiți prin formarea de aducti analit-amoniu . Acizi organici volatili, cum ar fi acidul acetic sau, mai frecvent, acidul formic , sunt adesea adăugați la faza mobilă dacă se utilizează spectrometria de masă pentru a analiza componenta de eluare a coloanei. Acidul trifluoracetic nu este adesea folosit în spectrometria de masă datorită faptului că rămâne în detector și în sistemul de alimentare cu solvent. Totuși, poate fi eficient în îmbunătățirea retenției analiților, cum ar fi acizii carboxilici . Efectele acizilor și soluțiilor tampon diferă în funcție de tipul de utilizare, dar în general îmbunătățesc rezultatele cromatografiei.
Coloanele RP-HPLC sunt relativ greu de deteriorat în comparație cu coloanele normale de silice. Cu toate acestea, multe coloane RP sunt alcătuite din derivați alchil de silicagel și sunt strict interzise să fie utilizate cu baze apoase deoarece vor distruge principalele particule de silicagel. Ele pot fi utilizate cu soluții apoase de acizi, dar coloana nu trebuie expusă la acizi pentru o perioadă lungă de timp, deoarece aceasta poate coroda părțile metalice ale aparatului HPLC. Coloanele RP-HPLC trebuie spălate cu solvent curat după utilizare pentru a îndepărta acizii reziduali și soluțiile tampon și depozitate în „solvent adecvat” (de exemplu, clătiți cu metanol și lăsați furtunurile pompei în alcool, astfel încât să nu pătrundă aer în coloană). Conținutul de metal al coloanelor HPLC trebuie menținut la un nivel scăzut dacă se dorește menținerea capacității de a separa substanțele în cel mai bun mod. Un test bun pentru conținutul de metal în coloană este injectarea unei probe care conține un amestec de 2,2’- și 4,4’-bipiridină ( bipiridină ). Deoarece 2,2’-bipiridina se poate chela cu metale, forma vârfului pentru 2,2’-bipiridina va fi distorsionată (cu o „coadă”) dacă ioni metalici sunt prezenți pe suprafața gelului de silice.
Matricele utilizate în HPLC sunt compuși anorganici precum silice ( silicagel ) sau alumină , sau polimeri organici precum polistiren (reticulat cu divinilbenzen) sau polimetacrilat. Silicagelul este, desigur, acum general acceptat.
Principalele caracteristici ale matricei:
Obținerea gelului de silice pentru HPLC:
Particule absorbante:
Dimensiunea porilor în HPLC este unul dintre cei mai importanți parametri. Cu cât dimensiunea porilor este mai mică, cu atât permeabilitatea lor pentru moleculele substanțelor eluate este mai slabă. Și, în consecință, cu atât capacitatea de sorbție a absorbanților este mai slabă. Cu cât porii sunt mai mari, cu atât este mai mică, în primul rând, stabilitatea mecanică a particulelor de sorbant și, în al doilea rând, cu cât suprafața de sorbție este mai mică, prin urmare, cu atât eficiența este mai slabă.
HPLC în fază normală:
HPLC cu fază inversă:
End-capping - protecția locurilor de absorbție negrefate prin grefare suplimentară cu molecule „mici”. Capacul hidrofob (C1, C2): selectivitate mai mare, umectabilitate mai slabă; capsare hidrofilă (diol): selectivitate mai mică, umectabilitate mai mare.