Ansamblul Golden Gate , de asemenea , clonarea Golden Gate, este o metodă de clonare a ADN -ului care vă permite să asamblați simultan și ordonat mai multe fragmente de ADN într-unul singur folosind endonucleaze de restricție de tip II și ADN ligaza bacteriofagului T4 [1] [2] . Asamblarea moleculei se realizează in vitro . Cele mai frecvent utilizate endonucleaze de restricție de tip II includ BsaI, BsmBI și BbsI.
Spre deosebire de cele mai comune restrictaze precum EcoRI și BamHI , enzimele de restricție utilizate pentru Golden Gate sunt capabile să taie ADN -ul în afara locului de recunoaștere și astfel să creeze capete lipicioase non-palindromice [3] . Datorită capacității de a obține oricare dintre cele 256 de variante diferite de capete lipicioase cu o lungime de 4 perechi de baze , devine posibilă asamblarea unei molecule de ADN dintr-un număr mare de fragmente folosind combinații de capete lipicioase [3] . În practică, aceasta înseamnă că secvența Golden Gate va fi practic fără întreruperi. În plus, deoarece secvența produsului de sinteză nu poartă un situs de recunoaștere a enzimei de restricție , odată asamblată corect, aceasta nu poate fi tăiată din nou de enzimele de restricție . Aceasta înseamnă că reacția devine practic ireversibilă [3] .
Protocolul obișnuit al ciclorului specifică fluctuațiile de temperatură de la 16 °C (optim pentru ligaze) la 37 °C (optim pentru enzimele de restricție) [4] . Această metodă de sinteză poate fi utilizată atât pentru o singură inserție fără sudură, cât și pentru asamblarea mai multor fragmente de ADN într-un tub [5] .
Secvențele care conțin „cusături” (urme ale utilizării sistemelor de clonare) se formează adesea ca urmare a adunării unui număr mare de fragmente. De exemplu, în metoda de asamblare multisegment Gateway , fragmentele de ADN sunt adăugate la fragmentul donor împreună cu secvențe att suplimentare care se potrivesc în segmentele adiacente. Aceasta duce la faptul că în produsul final fragmentele de ADN sunt separate prin secvențe att [6] . În ansamblul BioBrick , între fragmentele de ADN adăugate la plasmidă, rămâne o „cusătură” de opt nucleotide care codifică tirozină și un codon stop [6] .
Sinteza Golden Gate folosește enzime de restricție de tip II care taie secvența ADN în afara locului său de recunoaștere [6] . Aceeași enzimă de restricție de tip II poate crea diferite capete lipicioase pentru diferite secvențe de ADN. În special, folosind enzima BsaI, este teoretic posibil să se obțină fiecare dintre cele 256 de variante de capete lipicioase (lungime 4 bp) în prezența fragmentelor de ADN corespunzătoare [6] . Cu sinteza corectă a secțiunilor de capăt lipicioase, aceste fragmente sunt conectate fără „cusături” între părți. În unele cazuri, produsul final poate fi condiționat fără sudură - locurile de recunoaștere a enzimei de restricție pot fi lăsate pe ambele părți ale inserției multi-fragmentare în ADN-ul donor pentru a exciza întregul fragment în pașii următori [6] . Deoarece fragmente suplimentare de ADN pot fi inserate în vectori fără „cusături” în interiorul cadrului de citire deschis , metoda Golden Gate este utilizată pe scară largă în ingineria proteinelor [6] .
Deși sinteza Golden Gate accelerează asamblarea multi-segment, este util să se folosească arhitecturi speciale de plasmide pentru a crește randamentul [5] . La fiecare pas, metoda Golden Gate este capabilă să asambleze până la nouă fragmente de ADN. Acest lucru necesită ca capetele lipicioase ale fragmentelor de ADN adiacente care urmează să fie combinate să fie omoloage între ele, iar locurile de recunoaștere a enzimei de restricție să nu fie incluse în fragmentele excizate [5] . După ce fragmentele sunt ligate cu ADN ligază de bacteriofag T4, produsul nu va conține locuri de recunoaștere a enzimei de restricție IIS și nu va fi recut în continuarea reacției [5] . La rândul lor, situsurile neligate, dimpotrivă, pot interacționa cu enzima de restricție, adăugând astfel mai multe fragmente la amestecul de reacție [5] . Cu setarea corectă a experimentului și alegerea fragmentelor de ADN, se poate obține un produs liniar într-un singur ciclu [5] .
Ansamblul enzimei de restricție a secvenței ADN este reglementat de diferite standarde de donare pentru a minimiza degradarea eficienței clonării și întreruperea funcției plasmidei. Astfel de efecte pot fi cauzate de asamblarea incorectă, de exemplu, dacă există locuri de restricție neintenționate în interiorul inserției sau al vectorului [7] .
Există doi pași pentru clonarea Golden Gate [7] . În prima etapă, o secvență monogenă este asamblată din elemente precum un promotor , cadre de citire deschise și un terminator [7] . După aceea, la a doua etapă a ansamblării, se combină mai multe secvențe monogenice obținute în prima etapă [7] . Pentru implementarea ansamblului Golden Gate, care constă din 2 sau mai multe etape, se folosesc sistemele standard MoClo (clonare modulară) și GoldenBraid [7] .
Standardul MoClo împarte elementele genetice în 4 niveluri diferite:
MoClo utilizează o abordare paralelă în care toate modulele rezultate de nivel 0 au locuri de restricție BpiI pe ambele părți ale insertului. Vectorul în care vor fi adăugate genele are două situsuri de recunoaștere a enzimei de restricție BsaI inversate și un marker de selecție excizat între ele. [7] Adesea, gena lacZ acționează ca un astfel de marker , permițând selecția negativă a plasmidelor în care gena reporter a fost înlocuită cu succes cu ADN-ul asamblat [7] . Capetele lipicioase ale fiecărui modul de nivel 0 și vector țintă trebuie să fie complementare doar capetelor lipicioase ale fragmentului învecinat, succesiunea de combinații de capete lipicioase determinând arhitectura produsului final [7] . O construcție Golden Gate începe de obicei cu module de nivel 0 care conțin gene individuale [5] . Pentru a identifica site-urile de restricție neintenționate, este necesar să se efectueze secvențierea modulelor de nivel 0 [5] . Totuși, dacă modulele de nivel 0 sunt prea mari, ansamblul trebuie să înceapă cu secvențe de nivel −1, care trebuie și ele secvențiate [5] . Dacă ansamblul a fost pornit de la fragmente de nivel −1, modulele de nivel 0 nu trebuie să fie secvențiate din nou [5] .
Nivel -1Fragmentele de nivel −1 sunt utilizate în asamblarea modulelor lungi de nivel 0 [5] . Pentru a obține și dezvolta astfel de fragmente, se utilizează de obicei ligarea secvențelor cu capete contonate și PCR ulterioară [5] . Vectorul țintă nu trebuie să conțină enzima de restricție de tip II, care este utilizată în următoarea etapă de asamblare [5] .
Nivelul 0Modulele de nivel 0 sunt coloana vertebrală a sistemului MoClo, deoarece conțin elemente genetice complete, cum ar fi promotorul , regiunea 5’ netradusă (UTR) , secvența de codificare a proteinei și terminatorul [5] . Pentru o asamblare reușită a Golden Gate, secvențele interne ale modulelor de nivel 0 nu trebuie să conțină site-urile II de recunoaștere a enzimelor de restricție BsaI, BpiI și Esp3I, ci trebuie să fie flancate (adică flancate) de două situsuri de restricție BsaI în orientare inversă [5] .
Dacă, ca urmare a secvențierii, s-a constatat că modulul de nivel 0 conține un situs de restricție nedorit, atunci acesta poate fi mutat in silico prin îndepărtarea sau înlocuirea unei nucleotide [5] . În același timp, este necesar să ne asigurăm că mutația introdusă nu va afecta proprietățile produsului sintetizat din ADN (de obicei ARN sau proteină) [5] . Se recomandă introducerea mutațiilor sinonime în secvența de codificare a proteinei, deoarece acestea nu modifică secvența proteinei sintetizate și, prin urmare, nu afectează funcția genei [5] .
Nivelul 1Vectorul țintă de nivel 1 determină locația și direcția constructului inserat [8] . Într-un astfel de vector, gena marker de selecţie ( lacZ ) este flancată de două situsuri de restricţie pe fiecare parte. În acest caz, site-ul intern (BsaI) este inversat, iar site-ul extern (BpiI) este situat într-o orientare directă. Există 14 variante ale vectorului de nivel 1 care diferă în secvențele de capăt lipicioase pentru site-urile externe, dar nu diferă în secvențele de capăt lipicioase ale site-urilor interne [8] . Astfel, un set compus corect de module de nivel 0 poate fi clonat în oricare dintre acești vectori [8] .
Vectorii de nivel 1 sunt utilizați pentru expresia tranzitorie în plante conduse de Agrobacterium [8] .
Nivelul 2Vectorii țintă de nivel 2 au 2 situsuri de recunoaștere a enzimei de restricție BpiI inversate pentru inserarea modulelor de nivel 1 [8] . Locul de restricție din vector înainte de locul de inserție trebuie să fie complementar cu situsul înainte de începerea genei din modulul de nivelul 1, locul de restricție după locul de inserție este universal [8] . Cu fiecare clonare, 2 până la 6 gene pot fi inserate în vector [8] .
Adăugarea mai multor gene într-o singură etapă nu este de dorit, deoarece este probabil să conducă la asamblare greșită din cauza combinațiilor incorecte de sticky-end [8] .
Astfel, asamblarea constructelor constând din mai mult de 6 gene trebuie efectuată în mai multe etape. Acest lucru necesită secvențe terminale de linker care conțin site-urile de recunoaștere a enzimelor de restricție BsaI sau BsmBI într-o poziție inversată și un nou marker de selecție (albastru sau violet) [8] . În fiecare etapă, este necesară schimbarea enzimei de restricție și a markerului [8] . Când sunt ecranate , coloniile care conțin un vector asamblat corect își vor schimba culoarea la fiecare pas de asamblare (albastru spre violet), dar la ultima etapă, când se folosește un linker de capăt de închidere, culoarea coloniilor va fi albă [8] .
Nivel MVectorii țintă de nivel M sunt similari vectorilor de nivel 2, cu excepția prezenței unui sit BsaI înainte de perechea de situsuri BpiI inversate [9] . Când una sau mai multe gene sunt donate într-un vector de nivel M, se adaugă un al doilea situs de restricție BsaI cu o secvență de sfârșit linker specifică (M). Datorită acestui fapt, fragmentul care conține toate genele asamblate poate fi excizat și utilizat în următoarea etapă a clonării (nivel P) [8] .
Nivel PVectorii țintă de nivel P sunt similari cu cei de la nivelul M, dar situsurile BpiI sunt înlocuite cu BsaI și situsurile BsaI sunt înlocuite cu BpiI. Mai multe construcții de nivel M cu capete lipicioase compatibile pot fi donate în vectorul P țintă într-o singură etapă. În teorie, este posibil să se asambleze până la 36 de gene într-un singur construct atunci când rulează 6 reacții paralele ale nivelului M (șase gene fiecare), dar, în practică, sunt de obicei asamblate mai puține gene datorită faptului că nu sunt necesare construcții atât de mari. în majoritatea proiectelor [8 ] . În ciuda acestui fapt, vectorii de nivel M și P sunt proiectați în așa fel încât genele donate în vectorul de nivel P pot fi donate în continuare în vectorul de nivel M și invers [8] .
Conform protocolului standard Golden Gate, site-urile de restricție utilizate în etapa anterioară de clonare devin inaccesibile [10] . Asamblarea a mai mult de 6 gene necesită o enzimă de restricție de tip II diferită și introducerea situsurilor sale de recunoaștere corespunzătoare [10] . Acest lucru se poate face cu vectori de nivel 2 sau niveluri M și P. GoldenBraid oferă o variație a sistemului de nivel M și P.
Pentru clonarea conform metodei GoldenBraid se folosește un sistem de 4 plasmide capabile să formeze o buclă dublă (așa-numitele „ghirlande” - „împletitură”). Un astfel de sistem permite asamblarea binară a mai multor structuri simultan [10] .
Metoda de asamblare Golden Gate poate fi folosită și pentru a efectua mutageneza (Golden Mutagenesis). Această tehnologie este ușor de aplicat datorită instrumentelor online de selecție a primerului ( GoldenMutagenesis web tool ) și vectorilor [11] .