Analiza interacțiunii cromatinei prin secvențierea etichetelor cu capăt pereche (ChIA-PET) este o metodă biologică moleculară care vă permite să determinați interacțiunile (proximitatea spațială) ale regiunilor cromatinei situate la o distanță considerabilă unele de altele în genom . [1] Astfel de interacțiuni prezintă interes pentru determinarea elementelor de reglementare . Elementele de reglare din celule pot fi localizate la o distanță considerabilă de promotorul genei reglate (de exemplu, elemente de reglare cis , elemente de reglare trans , izolatori , amplificatori ). Pentru a înțelege mecanismele unor astfel de interacțiuni, este necesar să se cunoască aranjarea spațială a regiunilor cromatinei unele față de altele, pe care această metodă face posibilă determinarea de novo . La rândul lor, informațiile obținute sunt importante pentru înțelegerea mecanismelor de reglare a expresiei genelor . [2]
ChIA -PET se bazează pe utilizarea ChIP , 3C ( Determinarea conformației cromozomilor ) și secvențierea etichetelor cu sfârșit împerecheat , pentru care sunt utilizate secvențierea cu randament ridicat și procesarea computerizată ulterioară a rezultatelor. [3]
Metoda a fost folosită pentru prima dată în 2009 [1] pentru a determina locurile de legare ale ER-alfa la distanță în cancerul de sân uman. Ulterior, a fost folosit, de exemplu, pentru a construi un interactom (hartă a posibilelor interacțiuni) mediat de CTCF în celule stem embrionare de șoarece [ 4] .
ChIA-PET combină capacitățile ambelor metode bazate pe ChIP și 3C [5] , îmbunătățind capacitățile fiecăreia. Metoda tradițională ChIP vă permite să determinați interacțiunea unei anumite proteine cu ADN-ul și poate fi folosită pentru a căuta site-uri de legare a factorului de transcripție . Folosind ChIP-seq , situsurile de legare de novo ale proteinei de interes pot fi determinate în întregul genom. Dacă o proteină leagă regiuni ale cromatinei care sunt îndepărtate pe cromozom , dar apropiate în spațiu, ChIP-seq poate identifica fiecare dintre ele, dar nu indică interacțiunea lor. Cu toate acestea, nu toate secvențele determinate prin metoda ChIP-seq sunt mapate unic în genom și nu toate sunt site-uri de legare funcționale [6] .
Metodele 3C și ChIA-PET se bazează pe teoria ligării proximale ( proximity ligation ), care afirmă că capetele regiunilor cromatinei asociate cu complexul proteic, care sunt în apropiere, vor fi legate între ele cu o probabilitate mai mare decât capetele regiunilor în soluţie sau asociate cu un alt complex proteic.
Metoda 3C permite determinarea structurii spațiale a cromatinei, dar nu permite determinarea proteinei care interacționează [5] . O problemă semnificativă este necesitatea cunoașterii exacte a secvenței loci care interacționează . Acest lucru este necesar pentru selectarea primerilor pentru analiza PCR cantitativă sau semi- cantitativă utilizată pentru determinarea acestora. (De remarcat că pot exista mai mulți loci - candidați pentru interacțiuni - determinati prin metoda 3C). Metoda ChIA-PET permite determinarea de novo a structurii spațiale a cromatinei asociată cu o proteină specifică. Adică, pe de o parte, nu necesită cunoașterea secvenței ADN în zona de interacțiune și, pe de altă parte, depinde complet de specificul anticorpilor utilizați .
| ChIP | Chip secv | ChIA-PET | 3C | |
|---|---|---|---|---|
| Aveți nevoie de anticorpi specifici | + | + | + | - |
| Este necesar să se cunoască secvența ADN la locusul studiat | + | - | - | + |
| Genomul de referință este necesar | - | + | + | - |
| Metoda oferă informații despre | Site-uri de legare | Despre site-urile de legare de novo |
Despre situsurile de legare de novo + conformația cromatinei |
Conformatiilor cromatinei |
Complexele ADN-proteină sunt reticulate nespecific cu formaldehida. Proba este expusă la ultrasunete , în timp ce moleculele de ADN sunt zdrobite în fragmente și complexele nespecifice legate lejer sunt distruse. Ca urmare, fragmentele de ADN sunt obținute în complexe puternice cu proteine. Mai departe, cu ajutorul anticorpilor specifici fixați pe margele magnetice, sunt precipitate fragmente de cromatină asociate cu proteina de interes. Adesea obiectele de studiu sunt factori de transcripție cunoscuți [1] . Complexele precipitate sunt îndepărtate din soluție de margele magnetice folosind un magnet. Complexele izolate sunt împărțite în 2 alicote, iar semi- linkerii oligonucleotidici cu o secvență cunoscută sunt „cusuți” la capetele moleculelor de ADN . Semi-linkerul A este într-o alicotă , iar jumătate - linkerul B este în celălalt . linker A și AT pentru semilinker B. Ca rezultat, mai târziu, în timpul secvențierii, linkerii pot fi distinși unul de celălalt prin „codul de bare”. În etapa următoare, două părți alicote sunt combinate și are loc ligatura proximală, prin care semi-linkerii sunt legați unul peste altul pentru a forma linkeri de lungime completă. Linkerii cu „coduri de bare” AA (CG/CG) sau BB (AT/AT) sunt considerați produse de ligatură probabile în cadrul aceluiași complex, în timp ce linkerii cu „coduri de bare” AB (CG/AT) sunt considerați produse de ligatură himerice ale ADN-ului asociate cu diferite complexe de proteine Pregătirea pentru secvențiere implică procesarea complecșilor cu enzima de restricție MmeI [8] , care scindează ADN-ul la o anumită distanță de locul său de recunoaștere în semi-linker. Ca rezultat, la sfârșitul acestei etape, sunt obținute construcții care conțin o pereche de „etichete” ( etichetă ing. ) (20 bp fiecare) pe ambele părți ale linkerului complet (38 bp). Fragmentele rezultate sunt secvențiate la ambele capete ( PET ) . Etichetele sunt apoi mapate pe genom. [7] [9]
Procesarea computerizată a rezultatelor secvențierii include 6 module [7] [10]
Toate secvențele citite sunt împărțite în secvențe care au „coduri de bare” lizibile și „coduri de bare” care nu pot fi citite. Dacă „codul de bare” nu poate fi citit, atunci secvența este „eliminată” de la procesare. Dacă „codul de bare” poate fi citit, atunci secvențele sunt aliniate la linkerii. Toate secvențele obținute sunt împărțite în himerice (formate prin legarea ADN-ului din diferite complexe și care conțin linkerul A/B) și non-himerice (conținând linkerul A/A sau B/B). Trebuie remarcat faptul că printre secvențele care conțin A/A sau B/B pot apărea și cele himerice. Mai mult, secvenţele linkerilor înşişi sunt „aruncate” şi secvenţele „etichetelor” (PET) sunt analizate. [7] [10]
Cartografierea PET -urilorSecvențele obținute în etapa anterioară sunt mapate la genomul de referință. În prima etapă, sunt izolate secvențe aliniate 100% , care pot fi mapate la un loc (unic) sau la mai mulți loci. Dintre secvențele rămase, cele care conțin 1 substituție în secvență (în engleză missmatch ) cu genomul de referință sunt izolate, sunt de asemenea împărțite în secvențe unice și cu cartografiere multiplă. Toate celelalte secvențe nu sunt mapate. Toate secvențele, cu excepția celor mapate în mod unic, sunt „eliminate” de la procesare. [7] [10]
Clasificarea PET-urilorExistă două grupuri de PET: „self-ligated” ( în engleză self-ligation PETs ) și „interligated” ( în engleză inter-ligation PETs ). „Self-ligated” ( în engleză self-ligation PETs ) corespund capetelor unui fragment ChIP-ADN, ele ar trebui să fie situate pe același cromozom la mică distanță unul de celălalt, în orientarea „cap la coadă”. „Interligated” ( ing. inter-ligation PET ) sunt împărțite în intracromozomiale (cartografiate pe același cromozom la o distanță mare), intercromozomiale (cartografiate pe diferiți cromozomi) și ligatate în etichete de orientare diferită ( ing. different orientation ligation PETs ) (cartografiate pe același cromozom la o distanță mică, dar în orientare greșită sau pe diferite catene de ADN). Limita care separă PET-urile „auto-ligate” de PET-urile „interligate” este determinată în mod natural de lungimea fragmentelor de ADN obținute la o intensitate „sunet” dată. În diferite experimente a fost 3-4,6 Kb. [7] [10]
Determinarea situsurilor de legare a proteinelorEtichetele de auto-ligare ( auto-ligatura PET ) sunt utilizate pentru a determina situsurile de legare la proteine . Procedura este similară cu cea utilizată în ChIP-seq .
Definiția interacțiunilor cromatineiÎn predicția acestui tip de interacțiune, sunt utilizate PET-uri „inter-ligare” .
Vizualizarea și organizarea rezultatelorDatele din etapele anterioare sunt introduse în baze de date pentru stocare, prelucrare și posibilă vizualizare.
Următoarele programe de calculator sunt utilizate în experimentele ChIA-PET