Endonucleaze de restricție

Endonucleaze de restricție, enzime de restricție (din latină  restrictio  - restricție) - un grup de enzime aparținând clasei hidrolazelor care catalizează reacția de hidroliză a acizilor nucleici .

Spre deosebire de exonucleaze , enzimele de restricție nu scindează acizii nucleici de la capătul moleculei, ci la mijloc. În același timp, fiecare enzimă de restricție recunoaște o anumită secțiune de ADN cu o lungime de patru perechi de baze și scindează lanțul de nucleotide în interiorul locului de recunoaștere sau în afara acestuia.

Protecția genomului bacterian de propria sa enzimă de restricție se realizează prin metilarea reziduurilor nucleotidice ale adeninei și citozinei (mascare) [1] .

Când restricția este efectuată în condiții suboptime, endonucleazele prezintă activitate stelară (o scădere a specificității restricției).

Clasificare

Există trei tipuri principale (sau clase) de enzime de restricție , ale căror locuri de recunoaștere pot fi simetrice ( palindromice ) și asimetrice [2] :

• Enzimele de restricție de primul tip (de exemplu, Eco K din Escherichia coli K12) recunosc o anumită secvență de nucleotide și taie o moleculă de ADN dublu catenar în apropierea acestei secvențe într-un punct arbitrar, iar locul de tăiere în sine nu este strict specific (aparent, după formarea unui complex cu ADN, enzima interacționează nespecific cu regiunea ștearsă a ADN-ului sau se mișcă de-a lungul catenei de ADN).
• Enzimele de restricție de al doilea tip (de exemplu, Eco RI, Xbal ) recunosc o anumită secvență și taie dubla helix ADN la un anumit punct fix din această secvență. Enzimele de restricție de acest tip recunosc secvențele palindromice care au o axă centrală și sunt citite în mod egal de ambele părți ale axei de simetrie.
• Enzimele de restricție de al treilea tip intermediar (de exemplu, Eco PI) recunosc secvența dorită și taie molecula de ADN dublu catenar, retrăgând un anumit număr de perechi de nucleotide de la capătul său (sau în mai multe puncte la distanțe diferite de locul de recunoaștere) . În acest caz, fragmentele de ADN sunt formate fie cu capete netede (tocite), fie cu capete proeminente (lipicioase) 5'- sau 3'-capete. Aceste enzime de restricție recunosc locurile asimetrice. Aceste proprietăți sunt utilizate pe scară largă în diferite metode de asamblare a ADN-ului in vitro , cum ar fi asamblarea Golden Gate .

Până în 2007, au fost izolate peste trei mii de endonucleaze de restricție. [3] Peste șase sute de restrictaze sunt disponibile comercial și sunt utilizate în mod obișnuit în laboratoare pentru modificarea ADN-ului și inginerie genetică . [4] [5] [6]

Izoschizomeri

Izoschizomerii sunt perechi de endonucleaze de restricție care au o specificitate pentru recunoașterea acelorași secvențe, dar uneori diferă în prezența reziduurilor de nucleotide metilate și taie aceste secvențe în aceleași locuri. De exemplu, enzimele de restricție Sph I (CGTAC^G) și Bbu I (CGTAC^G) sunt izoschizomeri. Prima enzimă izolată pentru recunoașterea și tăierea specifică a unei anumite secvențe se numește prototip , iar toate celelalte enzime de restricție similare sunt numite izoschizomeri .

Izoschizomerii sunt izolați din diferite tulpini bacteriene și, prin urmare, diferiți izoschizomeri pot necesita condiții de reacție diferite .

Heteroschizomeri (neoschizomeri)

O enzimă care recunoaște aceeași secvență, dar o taie diferit se numește heteroschizomer (neoschizomer) . Izoschizomerii sunt astfel un caz special de heteroschizomeri. De exemplu, enzimele de restricție Sma I (GGG^CCC) și Xma I (G^GCCCC) sunt heteroschizomeri, dar nu izoschizomeri unul pentru celălalt.

Izocaudomeri

Enzimele de restricție care recunosc secvențe complet diferite, dar formează aceleași capete se numesc izocaudomeri .

Enzime de restricție artificiale

În inginerie genetică, restrictazele artificiale sunt utilizate pe scară largă, obținute prin fuziunea domeniului de legare ADN al degetului de zinc cu domeniul de tăiere ADN al nucleazei [7] [8] . Domeniul deget de zinc poate fi proiectat să recunoască și să se lege la o secvență ADN dorită [9] . O alternativă la nucleazele degete de zinc sunt enzimele de restricție artificiale TALEN obținute prin fuzionarea domeniului de legare la ADN al efectorului TAL cu domeniul de clivaj ADN [10] [11] [12] [13] .

Endonucleaze ghidate de ARN

Pentru a edita genomul în celulele umane, se folosesc și endonucleazele sistemului CRISPR - Cas9 , care scindează anumite secvențe de ADN la „vârful” ARN-ului complementar [14] [15] [16] [17] [18] [19] . Spre deosebire de zinc fingers și TALEN, sistemul CRISPR-Cas pentru recunoașterea ADN-ului necesită doar crearea unei secvențe de ARN „ghid” adecvate, și nu crearea de noi domenii proteice ale enzimei, ceea ce face această metodă mult mai accesibilă datorită simplității sale. și cost relativ scăzut [20] [21 ] [22] [23] [24] .

Înțeles

În biologia moleculară practică, cel mai des sunt utilizate enzimele de restricție de tip II, locul de recunoaștere pentru care în cele mai multe cazuri este un palindrom . Toate restrictazele de tip II sunt dependente de Mg 2+ .

Enzimele de restricție fac parte dintr-un sistem complex de restricție-modificare utilizat de celulele bacteriene pentru a regla conținutul și activitatea ADN-ului în celulă.

Descoperirea enzimelor de restricție în anii 1970 , împreună cu dezvoltarea metodelor de secvențiere a ADN-ului , a fost principalul imbold pentru dezvoltarea ingineriei genetice .

În prezent, enzimele de restricție cu diferite site-uri de recunoaștere sunt instrumentul principal pentru cercetarea genetică și inginerie genetică .

Vezi și

• Sistem de restricție-modificare
• Amprenta ADN-ului
• REBAZA
• CRISPR Cas13

Note

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molecular biology of the cell: in three volumes. - 2. - Moscova: Mir, 1994. - T. 1. - 517 p. — 10.000 de exemplare.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Ayala F. D. Genetica modernă. 1987.
3. ↑ Roberts RJ, Vincze T., Posfai J., Macelis D.  REBASE --enzymes and genes for DNA restriction and modification  // Nucleic Acids Res : jurnal. - 2007. - Vol. 35 , nr. Problema baza de date . - P.D269-70 . doi : 10.1093 / nar/gkl891 . — PMID 17202163 .
4. ↑ Primrose, Sandy B.; Vechi, RW Principiile manipulării genelor: o introducere în  ingineria genetică . - Oxford: Blackwell Scientific , 1994. - ISBN 0-632-03712-1 .
5. ↑ Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Știința ADN-ului de laborator: o introducere în tehnicile și metodele de  analiză a genomului ADN recombinant . — Menlo Park, California: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. - ISBN 0-8053-3040-2 .
6. ↑ Adrianne Massey; Helen Kreuzer. ADN recombinant și biotehnologie: un ghid pentru  studenți . -Washington, DC: ASM Press, 2001. - ISBN 1-55581-176-0 .
7. ↑ Carroll, D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188(4), 773-782. doi : 10.1534/genetics.111.131433
8. ↑ Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Repeatable Construction Method for Engineered Zinc Finger Nuclease Based on Overlap Extension PCR and TA-Cloning. PLoS ONE 8(3): e59801. doi : 10.1371/journal.pone.0059801
9. ↑ Zhu, C., Gupta, A., Hall, VL și colab. & Wolfe, SA (2013). Utilizarea interfețelor deget-deget definite ca unități de asamblare pentru construirea nucleazelor zinc-degete. Nucleic acids research, 41(4), 2455-246541 doi : 10.1093/nar/gks1357 .
10. ↑ Mussolino, C., & Cathomen, T. (2012). Nucleazele TALE: inginerie personalizată a genomului făcută ușoară. Opinia curentă în biotehnologie, 23(5), 644-650 doi : 10.1016/j.copbio.2012.01.013
11. ↑ Beumer, KJ, Trautman, JK, Christian, M., et al. & Carroll, D. (2013). Compararea nucleazelor cu degete de zinc și a nucleazelor efectoare asemănătoare activatorului de transcripție pentru țintirea genelor în Drosophila. G3: Genele| Genoame| Genetica, 3(10), 1717-1725 doi : 10.1534/g3.113.007260
12. ↑ Sun, N. și Zhao, H. (2013). Nucleaze efectoare asemănătoare activatorului de transcripție (TALENs): Un instrument extrem de eficient și versatil pentru editarea genomului. Biotehnologie și bioinginerie, 110(7), 1811-1821 doi : 10.1002/bit.24890
13. ^ Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Rapid Assembly of Customized TALENs into Multiple Delivery Systems . PLoS ONE 8(11): e80281. doi : 10.1371/journal.pone.0080281
14. ↑ Cho, SW, Kim, S., Kim, JM și Kim, JS (2013). Inginerie țintită a genomului în celule umane cu endonucleaza ghidată de ARN Cas9. Biotehnologia naturii, 31, 230-232. doi : 10.1038/nbt.2507
15. ↑ Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, et al. & Zhang, F. (2013) Specificitatea țintirii ADN a nucleazelor Cas9 ghidate de ARN. Nature biotechnology, 31(9), 827-832. doi : 10.1038/nbt.2647
16. ↑ Golic, KG (2013) Nucleazele ghidate de ARN: O nouă eră pentru proiectarea genomilor organismelor model și nonmodel. Genetics, 195(2), 303-308. doi : 10.1534/genetics.113.155093
17. ↑ Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J., et al. & Zhang, F. (2013). Ingineria genomului folosind sistemul CRISPR-Cas9. Nature protocols, 8(11), 2281-2308 doi : 10.1038/nprot.2013.143
18. ↑ Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) ARN-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing? Arhivat 5 decembrie 2013 la Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562-567, doi : 10.1016/j.tim.2013.09.001
19. ↑ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak și George Church (2014) CRISPR-Cas Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. În: Gene Corection. Metode și protocoale. Seria: Methods in Molecular Biology, Voi. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
20. ↑ Uri Ben-David (2013) Flushing through the CRISPR-CAScade: Will genome editing boost cell therapies? Arhivat 17 noiembrie 2015 la Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi : 10.1186/ 2052-8426-1-3
21. ^ Neena K. Pyzocha , F. Ann Ran, Patrick D. Hsu și Feng Zhang (2014) ARN-Guided Genome Editing of Mammalian Cells. În: Gene Corection. Metode și protocoale. Seria: Methods in Molecular Biology, Voi. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
22. ↑ Li, M., Suzuki, K., Kim, NY, Liu, GH și Belmonte, JCI (2013). O reducere peste restul: tehnologii de editare a genomului vizate în celulele stem pluripotente umane. Journal of Biological Chemistry, jbc-R113. doi : 10.1074/jbc.R113.488247
23. ↑ Slaymaker, IM, Gao, L., Zetsche, B., Scott, DA, Yan, WX și Zhang, F. Nucleazele Cas9 concepute rațional cu specificitate îmbunătățită  //  Science : journal. - 2016. - Vol. 351 , nr. 6268 . - P. 84-88 . - doi : 10.1126/science.aad5227 .
24. ↑ Kleinstiver BP, Pattanayak V., Prew MS, & J. Keith Joung și colab. Nucleaze CRISPR-Cas9 de înaltă fidelitate, fără efecte în afara țintă detectabile la nivelul întregului genom  (engleză)  // Nature: journal. - 2016. - doi : 10.1038/nature16526 .

Dicționare și enciclopedii	Britannica (online) Universalis
În cataloagele bibliografice	J9U : 987007533913205171 LCCN : sh85113284