STARR-Seq ( secvențierea regiunii de reglementare activă cu auto-transcriere ) este o metodă de analiză a activității de amplificare a milioane de secvențe ADN simultan din genomurile unor organisme arbitrare . STARR-seq are performanțe ridicate și poate fi utilizat pentru căutarea și cuantificarea la nivelul genomului a activității amplificatorului [1] .
La eucariote, transcripția este reglată de factori de transcripție - proteine care se leagă de anumite regiuni ADN din promotorii genei , precum și de regiuni care nu sunt situate în imediata apropiere a genelor, inclusiv a amplificatorilor . Amplificatorii sunt regiuni necodante ale ADN-ului care conțin site-uri de legare specifice pentru diverși factori de transcripție [2] . Amplificatorii recrutează factori de transcripție care activează ARN polimeraza II și factori generali de transcripție în apropierea promotorului, ceea ce duce la transcrierea genelor. Amplificatorii pot regla transcripția genelor țintă într-o manieră specifică țesutului [1] , indiferent de locația lor în ADN și de distanța față de promotorul genei. În unele cazuri, ele pot regla transcripția genelor situate pe un alt cromozom [3] . Cu toate acestea, până acum, informațiile s-au limitat la studiul unui număr mic de amplificatori datorită complexității căutării lor la nivel de genom [2] . În plus, multe elemente de reglare funcționează exclusiv în anumite tipuri de celule și în anumite condiții [4] .
Pentru a determina intensificatori in Drosophila , se foloseste o tehnica folosind o inserare aleatorie a unui transpozon care codifica un promotor minim cu o proteina reporter . Această metodă oferă informații despre reglarea genelor situate în apropierea locului de inserție de către amplificatori [5] .
În ultimii câțiva ani, diferite caracteristici ale amplificatorilor activi și inactivi au fost studiate folosind tehnologii post-genomice. Dezvoltarea de noi metode, cum ar fi DNase-seq , FAIRE-Seq , ChIP-seq , a făcut posibilă prezicerea poziției amplificatorilor în genom. Cu toate acestea, DNase-seq și FAIRE-seq nu permit determinarea directă a intensificatorului și a activității sale. În plus, aceste metode nu pot testa un număr mare de secvențe candidate pentru prezența activității de amplificator. Dezvoltarea STARR-seq face posibilă efectuarea unei căutări la nivel de genom pentru amplificatori și cuantificarea activității acestora [1] .
Ideea STARR-seq a fost propusă în laboratorul lui A. Stark (A. Stark, Institutul de Patologie Moleculară , Viena , Austria ) pentru o căutare la nivel de genom pentru amplificatori de organisme arbitrare, precum și pentru determinarea cantitativă a activităţii lor. Metoda se bazează pe faptul că amplificatorii pot funcționa indiferent de locația lor relativă pe ADN. Esența metodei constă în localizarea potențialului amplificator după promotorul minim, ceea ce permite amplificatorului activ să activeze transcripția ADN-ului care conține propria sa secvență. Activitatea fiecărui amplificator este caracterizată de gradul de îmbogățire a ARN -ului cu secvența de amplificator dintre tot ARN-ul celular. Folosind această abordare, este posibilă verificarea simultană a milioane de secțiuni ADN dintr-o sursă arbitrară [1] .
ADN-ul genomic este rupt aleatoriu în fragmente mici. Sunt selectate fragmente de o anumită lungime, adaptoarele sunt legate de ele. Fragmentele de ADN cu adaptoare sunt apoi amplificate . Produsele PCR sunt purificate și inserate în plasmidă după promotorul minim din regiunea 3’-netradusă a genei reporter, permițând amplificatorului activ să activeze transcripția prin ARN polimerază a unei regiuni ADN care conține, după punctul de început al transcripției, secvența. a intensificatorului însuși. Celulele sunt apoi transfectate cu biblioteca reporter rezultată și cultivate. ARN-ul poliadenilat este izolat din ARN-ul total și ADNc-ul este obținut prin transcripție inversă , care este amplificată, după care secvența fragmentelor este recunoscută prin secvențierea la capătul perechi . Fragmentele secvențiate sunt mapate la genomul de referință și datele sunt trimise pentru prelucrare computerizată [1] .
Metoda STARR-seq a fost aplicată inițial genomului Drosophila . S-a constatat că majoritatea (55,6%) dintre amplificatori sunt localizați în introni , în special în primul intron și regiunile intergenice. Este interesant că o mică parte (4,5%) de amplificatori sunt localizați la locurile de pornire a transcripției și, prin urmare, se poate presupune că acești amplificatori pot începe atât transcrierea la acest site, cât și pot afecta transcrierea altor gene. Cei mai activi amplificatori sunt localizați în apropierea genelor constitutive , cum ar fi cele care codifică proteinele citoscheletice , și a unor regulatori de dezvoltare, cum ar fi factorii de transcripție. Autorii au arătat că multe gene sunt reglementate de mai mulți amplificatori activi independenți. În plus, s-a dovedit că nivelurile de expresie a genelor în medie se corelează cu activitatea totală a amplificatorului per genă, ceea ce asigură o relație directă între nivelul de expresie și activitatea amplificatorului [1] .
Folosind STARR-seq pentru a căuta și a caracteriza variantele de alele de reglementare , Vockey și colab. au descoperit efectele variației genetice umane asupra funcției elementelor de reglementare necodante prin măsurarea activității a 100 de potențiali potențiali din genomul a 95 de indivizi. Această abordare face posibilă identificarea variantelor de reglare (inclusiv SNP -uri) localizate în loci genomici care contribuie la modificări ale nivelurilor de expresie ale diferitelor ARNm ( eQTL ), precum și contribuie la fenotipuri complexe [7] .
Metoda STARR-seq are următoarele avantaje:
STARR-seq combină metodele clasice de biologie moleculară cu metode bioinformatice înalt specializate pentru a detecta și cuantifica activitatea amplificatorului. Până în prezent, STARR-seq a fost aplicat în celule de șoarece și umane, iar eficacitatea sa a fost confirmată [8] . Aplicarea STARR-seq la o varietate de tipuri de celule ale diferitelor organisme va face posibilă realizarea unui pas semnificativ în studiul reglării genelor și a căilor de semnalizare responsabile de aceasta în timpul dezvoltării și diferențierii celulare , în condiții normale și patologice [6]. ] .