Metoda ana-telofazică pentru analiza aberațiilor cromozomiale

O analiză antelofazică  este un test genetic bazat pe înregistrarea vizuală a aberațiilor cromozomiale (leziuni cromozomiale) în stadiile anafazice și telofaze ale ciclului celular mitotic . Analiza anatelofazei este o metodă simplă, economică, care nu necesită cunoașterea cariotipului și identificarea cromozomilor. Vă permite să identificați doar anumite tipuri de aberații cromozomiale , dar sensibilitatea sa este destul de suficientă pentru a concluziona un factor „ mutagen ” sau „ non-mutagenic ”. Analiza anatelofazei este destul de sensibilă, corectă și convenabilă în prima etapă a cercetării ecotoxicogenetice [1] .

Istorie

Emisiile de genotoxici în mediu ca urmare a activităților umane necesită teste genetice adecvate pentru a evalua impactul potențial al acestor factori asupra ecosistemelor. Analiza anatelofazei a fost descrisă ca un test genetic rapid și economic. Printre primele studii în care s-a aplicat această analiză trebuie remarcate experimentele pe ceapă ( A. Levan ). Până în prezent, a fost folosită ca metodă principală de analiză genetică pentru sistemul de testare a plantelor de testare Allium , care studiază efectul diferitelor substanțe genotoxice asupra celulelor meristeme radiculare [2] [3] [4] .

Sensibilitate și aplicabilitate

Analiza ana-telofază este foarte sensibilă pentru teste de direcții foarte diferite. Fie că este vorba de mostre de substraturi din mediul înconjurător ( apă , sol , sedimente de fund ) sau de substanțe de origine antropică, precum și de radiații din diferite spectre (atât ionizante, cât și neionizante). În plus, avantajul acestei analize este versatilitatea ei (este aplicabilă în aproape toate cazurile când apare mitoza ) și ușurința în pregătirea preparatelor, care este foarte importantă atunci când se lucrează cu celule animale [5] . Analiza antelofazică a aberațiilor cromozomiale din celulele de ceapă ( Allium cepa ) este recomandată ca instrument pentru citomonitorizarea mediului. Măsurând genotoxicitatea, contribuie la evaluarea gradului de risc pentru mediu din produsele de uz casnic și industriale, care sunt introduse în mod constant și devin din ce în ce mai importante în viața de zi cu zi [2] [6] .

Tehnica de analiză

Include analiza la microscop a unui preparat de celule fixate și colorate în stadiul de proliferare . Există o serie de variații ale analizei antelofazei. Astfel, conform versiunii originale a analizei descrise de Fiskesjo ( 1985 ), primele 100 de celule anafazate și telofaze sunt luate în considerare la preparat, dintre care se notează celule aberante . Mai târziu, a început să fie folosită o versiune diferită a lui I. M. Prokhorov și colab. (2003), care ia în considerare toate anafazele și telofazele de pe preparat, printre care se remarcă și cele aberante . Anafazele nu foarte timpurii și telofazele timpurii sunt potrivite pentru contabilizarea aberațiilor cromozomiale . Deoarece o celulă de divizare nu se răspândește întotdeauna pe preparat de-a lungul axei longitudinale de diviziune, atunci când se selectează celule adecvate pentru numărarea aberațiilor cromozomiale, trebuie să se țină cont de distanța dintre nucleii fiice  - aceasta trebuie să fie nu mai mică decât dimensiunea unuia dintre ei [1] [2] [6 ] .

Tipuri de aberații analizate

La etapele anafazice și telofazice se calculează două categorii de aberații, clasice pentru această analiză, care sunt materialul cromozomial rămas în urmă polilor (fragmente și inele acentrice, cromozomi întârziați) și punți. Toate sunt destul de clar vizibile vizual și distinse. Foarte des, întârzierile și depășirile care indică modificări ale axului de acromatină sunt incluse și numărate într-o categorie separată.

1. Fragmentele și inelele acentrice pot fi simple sau pereche. Sunt situate între stelele copil sau departe de ele. Sarcina principală este de a recunoaște unicitatea sau împerecherea și de a le distinge de cromozomii întârziați. Fragmentele simple sunt fragmente de origine cromatidă. Pierderea unui fragment dintr-o pereche (de origine cromozomială) este în mod evident un fenomen rar, deoarece atracția dintre cromatidele surori se păstrează chiar și în stadiul anafazic. Din același motiv, este puțin probabil ca un singur fragment să poată apărea din cauza fuziunii cromatidelor surori ale fragmentului pereche și a desfășurării lor pe lungime.
2. Fragmentele pereche sunt fragmente de origine izocromatidă sau cromozomială. Putem vorbi despre legătura dintre capetele deteriorate ale cromatidelor surori și nu despre cromozomul întârziat, doar dacă fragmentul pereche are un aspect arcuit. Trebuie remarcat faptul că evaluarea acestei caracteristici este extrem de dificilă și, prin urmare, nu poate fi efectuată în toate cazurile.
3. Punțile sunt uneori împărțite în punți cromozomiale și cromatide. O punte cromozomală este înțeleasă ca un cromozom dicentric: este formată din două cromatide, cel mai adesea încrucișate. Puntea cromatidă este o cromatidă dicentrică, deci este văzută ca o singură cromatidă. După „grosimea” punții, nu se poate judeca caracterul cromozomial sau cromatidic al acesteia. Nu este întotdeauna posibil să se diferențieze natura punții și, prin urmare, nu este recomandabil să se efectueze o astfel de separare folosind metoda de colorare a cromozomilor totale, care nu permite identificarea cromatidelor individuale.
4. Cromozomii sau cromatidele întârziați sunt cel mai adesea ușor de recunoscut, deoarece pot fi priviți ca un centromer sau o eterogenitate structurală, ceea ce nu este tipic pentru fragmente. Cele mai mari dificultăți apar atunci când este necesar să se distingă cromatida metacentrică întârziată de cromozomul acrocentric. În același timp, răspunsul la această întrebare este important, deoarece, ca urmare a rămânerii în spatele cromozomului, se formează două celule hipoploide și, ca urmare a rămânerii în urma cromatidei, una hipoploidă și una normală.

Nu poate exista un standard absolut pentru contabilizarea aberațiilor și pentru prezentarea rezultatelor obținute. În practică, există combinații de diferite tipuri de aberații în aceeași celulă. Teoretic, se poate aștepta orice combinație de aberații. Baza pentru aceasta este asincronia reduplicării materialului ereditar. În plus, pe parcurs, pot fi înregistrate și alte tipuri de aberații, mai puțin frecvente, precum mitozele multipolare și poliploidia [6] .

Calcularea ratei de mutație

Desemnare	Caracteristică	Calcul
XA+abs.	XA+abs., %  — frecvența aberațiilor cromozomiale și a întârzierilor Frecvența aberațiilor și întârzierilor cromozomiale  este calculată ca raportul dintre suma celulelor ana- și telofaze în care au fost înregistrate încălcări și numărul total de ana-telefaze analizate.	, unde XA+oți.  este suma celulelor aberante din stadiile ana- și telofaze , iar N(A+T)  este numărul total de anafaze și telofaze analizate pe preparat.

Transformare

Frecvența aberațiilor și întârzierilor cromozomiale poate fi reprezentată ca severitate a efectului mutagen, conform sistemului de evaluare integrală a efectului mutagen.

Recomandări pentru efectuarea unei analize antelofazice

Pentru majoritatea studiilor, pot fi recomandate următoarele:

1. O condiție importantă în aprecierea tipurilor (spectrul și frecvența aberațiilor cromozomiale) este luarea în considerare a acestora în prima diviziune celulară după acțiunea mutagenului. Acest lucru se datorează faptului că o parte semnificativă a aberațiilor și a celulelor aberante este eliminată după prima diviziune sau capătă o formă diferită, deși unele aberații cromozomiale, care se observă sub formă de punți, pot persista timp de 12-15 cicluri mitotice.
2. Nu analizați rearanjamentele atunci când celulele sunt suprapuse și când integritatea membranei lor este încălcată.
3. Luați în considerare toate tipurile de modificări morfologice, care pot fi luate în considerare cu această tehnică.
4. Analizați modificările celulă cu celulă, adică înregistrați în protocolul de experimente compatibilitatea aberațiilor care apar în fiecare celulă.
5. Celulele în care nu este posibil să se determine tipul de aberații ar trebui să fie atribuite clasei de celule cu aberații nesortate; numărați-le numai în calculul numărului total de celule aberante.
6. Fiți extrem de atenți atunci când combinați date de orice fel (de exemplu, date din replici unice și date din experimente similare, din fragmente de puncte și inele, din dicentrice și acentrice însoțitoare etc.). Dacă validitatea unei asocieri este dovedită pentru un obiect sau condiții, atunci pentru alte obiecte și condiții trebuie verificată în mod special.
7. La prezentarea datelor într-un articol, este necesar să se indice numărul de indivizi examinați (sau repetări ale experimentului), numărul de celule analizate, numărul fiecăruia dintre tipurile de aberații luate în considerare, tipurile de celule aberante și frecvența lor și numărul de celule aneuploide.

Pentru o determinare exactă este necesară cunoaşterea structurii cariotipului speciei de plante sau animale studiate în normă [6] .

Metode și obiecte bazate pe această metodă

• Testul Allium
• Testul Vicia

Vezi și

• Analiza metafază
  • Testul Allium
• Indicele mitotic
• Rearanjamente cromozomiale

Note

1. ↑ 1 2 Prokhorova I. M., Fomicheva P. N., Kovaleva M. I. Evaluarea efectelor mitotoxice și mutagenice ale factorilor de mediu // YarSU: Guidelines. - Iaroslavl: YarGU, 2003. - S. 23.26 .
2. ↑ 1 2 3 Jet Rank. Metoda testului de aberație cromozomală Allium anaphase-telophase // Ekologija. - Vilnius, 2003. - T. 1 . - S. 38-42 .
3. ↑ Levan Albert. EFECTUL COLCHICINEI ASUPRA MITOZELOR RĂDĂCINII ÎN ALLIUM // Hereditas. - 1938. - T. 24 , nr. 4 . — S. 471-486 .
4. ↑ Fiskesjo G. Testul Allium ca standard în monitorizarea mediului  // Hereditas. - 1985. - T. 102 . - S. 99-112 .
5. ↑ W. Venegas, C. Lasne, R. Lowy, J.-P. Buisson şi I. Chouroulinkov. Naftofuranii au indus aberații cromozomiale detectate în celulele de hamster chinezesc V79 în metafază, anafază și telofază // Cercetarea mutațiilor/Toxicologie genetică. - Elsevier BV, 1985. - S. 53-62 .
6. ↑ 1 2 3 4 Kalaev V.N., Karpova S.S. Monitorizarea citogenetică: metode de evaluare a poluării mediului și a stării aparatului genetic al organismului. - VSU, 2004. - 80 p.

Link -uri

• Song D.S., Romanovsky A.V. Mitoza într-o celulă vegetală: normă și patologie  : Ghid științific și practic. - Moscova: JRE - IRE-i. V.A.Kotelnikov RAS, 2010. - P. 929 .