Hibridare fluorescentă in situ

Hibridizarea fluorescentă in situ , sau metoda FISH ( hibridizare fluorescență in situ - FISH ), este o metodă citogenetică  care este utilizată pentru a detecta și determina poziția unei secvențe specifice de ADN pe cromozomii de metafază sau în nucleele interfazice in situ . În plus, FISH este utilizat pentru a detecta mARN -uri specifice într-o probă de țesut . În acest din urmă caz, metoda FISH face posibilă stabilirea caracteristicilor spațio-temporale ale expresiei genelor în celule și țesuturi.

Metoda FISH este utilizată în diagnosticul genetic preimplantare , prenatal și postnatal [1] , în diagnosticul bolilor oncologice [2] , în dozimetria biologică retrospectivă [3] .

Sonde

Hibridizarea in situ prin fluorescență utilizează sonde ADN (sonde ADN) care se leagă de ținte complementare din probă. Sondele ADN conțin nucleozide marcate cu fluorofori (marcare directă) sau conjugate precum biotina sau digoxigenina (marcare indirectă). Cu marcare directă, sonda ADN legată de țintă poate fi observată cu un microscop cu fluorescență imediat după finalizarea hibridizării . În cazul etichetării indirecte, este necesară o procedură suplimentară de colorare, în timpul căreia biotina este detectată folosind avidină sau streptavidină marcată fluorescent și digoxigenina folosind anticorpi marcați fluorescent . Deși varianta indirectă de etichetare a sondei ADN necesită reactivi suplimentari și costuri de timp, această metodă face de obicei posibilă atingerea unui nivel de semnal mai ridicat datorită prezenței a 3-4 molecule de fluorocrom pe un anticorp sau o moleculă de avidină. În plus, în cazul etichetării indirecte, este posibilă amplificarea în cascadă a semnalului [4] .

Pentru a crea sonde de ADN, se folosesc secvențe de ADN donate (de exemplu, clone de legare Noi I ale celui de-al treilea cromozom uman , clone BAC ) [5] [6] , ADN genomic , produse PCR , oligonucleotide marcate , precum și ADN, obținut prin microdisecție [4] .

Marcarea sondei poate fi efectuată în diferite moduri, de exemplu, prin nick-translație sau prin PCR cu nucleotide marcate .

Procedura de hibridizare

Primul pas este proiectarea sondelor. Mărimea sondei ar trebui să fie suficient de mare pentru ca hibridizarea să aibă loc la un loc specific, dar nu prea mare (nu mai mult de 1 kb) pentru a nu interfera cu procesul de hibridizare. Când se identifică loci specifici sau când se colorează cromozomi întregi, este necesar să se blocheze hibridizarea sondelor ADN cu secvențe ADN repetitive neunice prin adăugarea de repetări ADN nemarcate (de exemplu, ADN Cot-1 ) la amestecul de hibridizare. Dacă sonda ADN este ADN dublu catenar, aceasta trebuie denaturată înainte de hibridizare.

În următoarea etapă, se pregătesc preparate de nuclee interfazice sau cromozomi metafazici. Celulele sunt fixate pe un substrat, de obicei o lamă de sticlă, urmată de denaturarea ADN-ului . Pentru a păstra morfologia cromozomilor sau a nucleelor, denaturarea se realizează în prezența formamidei , ceea ce face posibilă reducerea temperaturii de denaturare la 70 °C.

Apoi, probele sunt adăugate la preparat și hibridizarea este efectuată timp de aproximativ 12 ore. Apoi petreceți mai multe etape de spălare pentru a îndepărta toate sondele nehibridate.

Vizualizarea sondelor de ADN legate se realizează folosind un microscop fluorescent. Intensitatea semnalului fluorescent depinde de mulți factori - eficiența de etichetare a sondei, tipul de sondă și tipul de colorant fluorescent.

Vezi și

RGEN-ISL Metodă de imagistică moleculară care utilizează endonuclează direcționată de ARN CRISPR/dCas9 asociată cu o etichetă. Spre deosebire de hibridizarea fluorescentă clasică in situ, RGEN-ISL nu necesită denaturarea ADN-ului și, prin urmare, asigură o mai bună conservare a structurii cromatinei.

Note

1. ↑ Shilova N. V., Zolotukhina T. V. Interphase fluorescent in situ hybridization in the diagnostic of numerical chromosome aberations // Medical Genetics. - 2007. - T. 6. - Nr. 10. - S. 53-58.
2. ↑ Bridge JA, Cushman-Vokoun AM . Diagnosticarea moleculară a tumorilor țesuturilor moi  (neopr.)  // Archives of Pathology & Laboratory Medicine . - 2011. - Mai ( vol. 135 , nr. 5 ). - S. 588-601 . - doi : 10.1043/2010-0594-RAIR.1 . — PMID 21526957 .
3. ↑ Ainsbury EA, Bakhanova E., Barquinero JF et al. Revizuirea tehnicilor de dozimetrie retrospectivă pentru expunerile la radiații ionizante externe  // Dosimetrie de protecție împotriva radiațiilor  : jurnal  . - 2011. - noiembrie ( vol. 147 , nr. 4 ). - P. 573-592 . doi : 10.1093 / rpd/ncq499 . — PMID 21183550 . Arhivat din original pe 20 noiembrie 2015.
4. ↑ 1 2 Rubtsov N. B. Metode de lucru cu cromozomi de mamifere: Proc. indemnizatie . - Novosibirsk : Novosib. stat un-t , 2006. - 152 p. — ISBN 5-94356-376-8 . Arhivat pe 2 aprilie 2015 la Wayback Machine
5. ↑ Sazanov AA, Sazanova AL, Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Romanov MN, Malewski T., Smirnov AF Localizarea cromozomală a șapte HSA3q13→q23 NotI care leagă clonele de pe microcromozomi de pui: ortologia GGA14 și GGA15 a regiunii bogate în gene HSA3  (engleză)  // Cercetare citogenetică și genomică : revista. - Basel , Elveția : Karger Publishers , 2005. - Vol. 111, nr. 2 . - P. 128-133. — ISSN 1424-8581 . - doi : 10.1159/000086381 . — PMID 16103653 . Arhivat din original pe 15 martie 2015.  (Accesat: 15 martie 2015)
6. ↑ Sazanov AA, Romanov MN, Sazanova AL, Korczak M., Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Smirnov AF, Jaszczak K., Dodgson JB Localizarea cromozomală a 15 clone BAC de inserție mari care conțin trei microsateliți pe cromozomul de pui (GGA44)4 refine its centromer position  // Animal Genetics  : journal  . - Oxford , Marea Britanie : Societatea Internațională de Genetică Animală; Blackwell Publishers Ltd , 2005. Vol. 36, nr. 2 . - P. 161-163. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x . — PMID 15771730 . Arhivat din original pe 2 aprilie 2015.  (Accesat: 15 martie 2015)

Literatură

• Rubtsov N.B. Hibridarea in situ a acizilor nucleici în analiza anomaliilor cromozomiale // Metode genetice moleculare în diagnosticul bolilor ereditare şi oncologice. Introducere în Diagnosticarea Moleculară / Ed. M. A. Paltseva, D. V. Zaletaeva. - M .: Medicină , 2011. - T. 2. - S. 100-136. - 1000 de exemplare.  - ISBN 978-5-225-03557-0 .

Dicționare și enciclopedii	mare chinezesc mare chinezesc Britannica (online)