Calponina ( ing. Calponin ) este un membru al familiei de proteine care leagă actina, tipice în principal pentru celulele musculare netede care leagă actina G și F. Calponinele sunt produsul a 3 gene și sunt împărțite în așa-numita α-calponină (h1 sau bazică, 292 a.k. , 34 kDa), β-calponină (252 a.k.) - care este produsul aceleiași gene ca și α-calponina , dar având o deleție de aminoacizi în segmentul 216-256. Alte două izoforme, calponina neutră (calponina h2) și calponina acidă, sunt exprimate în celulele musculare netede și non-musculare. Alți reprezentanți ai calponinelor sunt SM22 și transgelina. Calponina își ia numele de la domeniul CH sau Calponin Homology, prezent printre multe ABP ( Actin-binding proteins ). În ciuda acestui fapt , calponina nu arată legarea actinei prin acest situs (Gimona și Mital, 1998), ci leagă lipidele (Bogatcheva și Gusev, 1995; Fujii și colab., 1995). Se crede că situsul de legare a actinei (Mezgueldi şi colab., 1992) este situat în regiunea dintre domeniul CH şi repetiţiile asemănătoare calponinei (CLIK - repetiţie asemănătoare calponinei). Calponina este termostabilă. Greutatea moleculară a izoformei mușchiului neted este de 34 kDa. Alte țesuturi prezintă izoforme de calponină mai acide care nu leagă calciul , ci leagă calmodulina . Legarea Ca2 + /calmodulină inhibă legarea la actină. Fosforilarea calponinei de către serin-treonin kinaze duce la un efect similar . Calponina are, de asemenea, un situs de legare a tropomiozinei .
Calponina este o proteină care leagă actina, calmodulina și tropomiozina care a fost găsită în țesuturile musculare netede ale mai multor vertebrate și în unele celule non-musculare. În timpul preparării filamentelor subțiri de stomac de pui , s-a demonstrat că acestea conțin actină, tropomiozină, caldesmon și calponină într-un raport molar de 7:0,9:0,6:0,7. La fel ca caldesmonul, calponina inhibă activitatea actomiozin- ATPazei în soluție, alunecând actina în raport cu miozina fosforilată in vitro , iar această inhibare este declanșată de Ca2 + /calmodulină. Inhibarea este abolită prin fosforilarea proteinelor in vitro . Aceste proprietăți sugerează că calponina poate fi un regulator suplimentar al interacțiunilor actină-miozină.
Digestia chimotriptică completă sau parțială a calponinei se efectuează la 25°C utilizând un raport în greutate de protează la substrat de 1:100 sau, respectiv, 1:1000, în imidazol 10 mM - HCI , 30 mM NaCI , 2 mM MgCl2 , 4 mM NaN3 , pH 7,0, în absența sau prezența actinei F (4 mg/ml) (raport molar actină/calponină = 3:1). La intervale de timp adecvate (0-60 min), cantități bine definite de proteine sunt amestecate cu un volum egal de tampon de probă de fierbere Laemmli și pregătite pentru electroforeza pe gel . Pentru reacțiile de reticulare și experimentele de legare, digestia este terminată cu 2,5 mM fluorură de fenilmetilsulfonil (PMSF) . Hidroliza totală a complexului covalent calponină-actină (11 mg/ml) cu CNBr (67 mg/ml adăugat în două cantități egale) este efectuată timp de 24 de ore în 70% acid formic - 14 mM p-mercaptoetanol.
Calponină (0,7-1,3 mg/mL) în 10 mM imidazol-HCI, 30 mM NaCI, 2 mM MgCl2, 4 mM NaN3, pH 7,0, amestecată cu F-actină nativă sau scindată cu subtilizină (2,4-4,5 mg/mL) ( Raportul molar calponină/actină = 1:3) în prezența a 2 mM EDC și 5 mM NHS. Reacția a fost efectuată la 25°C timp de 0-30 min și a fost monitorizată prin electroforeză pe gel SDS. Caldesmon (1,4 mg/ml) se leagă la F-actină în aceleași condiții folosind un raport molar al proteinelor de 1:6. Legătura covalentă dintre F-actină și fragmentul chimotriptic NH2-terminal de 22 kDa al calponinei se obține după cum urmează: 60 min de digestie chimotriptică a calponinei, la un raport de greutate enzimă la substrat de 1:1000, este suplimentată cu F-actină la un raport molar de 1:3, după centrifugare la 180.000 x g timp de 1 oră la 4°C, peletul este resuspendat în tampon imidazol-HCI, pH 7,0. Pentru separarea preparativă a aductului de F-actin-calponină de 76 kDa din calponină nereticulat, o soluție de F-actin-calponină reticulat (110 mg proteină) obținută după 45 de minute de reacție a fost ajustată în 3 mM β-mercaptoetanol, dializată peste noapte la 4°C împotriva tamponului de depolimerizare (50 mM Tris-HCI, 0,6 m KI, 5 mM tiosulfat de sodiu, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCI2 și 0,5 mM β-mercaptoetanol, pH 7,5) și apoi gelul este filtrat prin o coloană de Sephacryl-S-300 (1,6 x 120 cm), echilibrată la 4°C în același tampon. Fracțiunile proteice inițiale sunt eluate conținând un aduct de 76 kDa lipsit de calponină liberă, așa cum s-a analizat prin electroforeză pe gel. Fracțiile reunite sunt dializate cu apă distilată, liofilizate și supuse digestiei cu CNBr .