Secvențierea nanoporilor este o familie de metode de secvențiere a ADN -ului sau ARN -ului de generația a treia extrem de eficiente [1] . Metoda se bazează pe utilizarea proteinelor, în stare solidă sau a altor pori cu un diametru de câțiva nanometri care sunt sensibili la acizii nucleici.
Secvențierea nanoporilor evită etapele PCR - amplificare și etichetare chimică a unei probe de ADN sau ARN [2] . Acesta este un avantaj semnificativ față de alte metode de secvențiere care utilizează cel puțin unul dintre acești pași. Capacitățile metodei includ genotipare relativ ieftină , mobilitate ridicată, analiză rapidă și afișarea în timp real a rezultatelor. Utilizarea metodei în detectarea rapidă a agenților patogeni virali [3] , urmărirea rezistenței bacteriene [4] , secvențierea genomului uman [5] [6] și plantelor [7] , haplotiparea [8] , urmărirea virusului Ebola [9] și altele câmpurile au fost descrise.
În 1989, a fost demonstrată crearea de canale ( nanopori ) într-o membrană fosfolipidă artificială de către alfa-toxina sintetizată de Staphylococcus aureus [10] [11] . În 1995, a fost propusă pentru prima dată ideea secvențierii nanoporilor - determinarea proprietăților unui polimer liniar atunci când este tras printr-un por dintr-o membrană. La trecerea printr-un por, polimerul interacționează cu acesta într-un anumit mod, ceea ce face posibilă determinarea proprietăților acestuia [12] . Un an mai târziu, în 1996, a apărut prima lucrare care descrie posibilitatea utilizării nanoporilor ( alfa-hemolizină a fost folosită ca nanopor ) pentru a caracteriza acizii nucleici [13] .
În 1999-2000, s-a demonstrat că, folosind stafilococ alfa-hemolizina ca nanopor , este posibil să se distingă ARN monocatenar de ADN monocatenar [14] [15] .
În anul 2001, pentru prima dată, s-au efectuat lucrări în care s-a determinat prezența unor secvențe scurte de ADN folosind nanopori [16] . Abia până în 2009 a fost posibilă demonstrarea capacității de a distinge toate bazele din secvența ADN cu nanopori, ceea ce este necesar pentru crearea metodelor de secvențiere [17] .
În 2012, Oxford Nanopore Technologies a demonstrat primele secvențiere nanopore : GridION și MinION [18] .
În același timp, s-a arătat și posibilitatea fundamentală de utilizare a acestei metode - genomul bacteriofagului phiX a fost secvențiat cu o lungime de 5,4 mii de perechi de baze (bp) [19] .
Un sistem de nanopori este o cameră de reacție împărțită în două părți de o membrană care conține o gaură de dimensiuni nanometrice, un nanopor. Pe părțile camerei se aplică o tensiune , în urma căreia moleculele studiate trec prin por în direcția câmpului electric . Când o moleculă de acid nucleic trece printr-un por, nucleotidele individuale afectează unul sau altul parametru măsurat al sistemului, ceea ce face posibilă determinarea secvenței de nucleotide [2] . Într-o versiune folosită practic a secvențierii nanoporilor, camera este umplută cu o soluție electrolitică și se măsoară puterea curentului ionilor care curge prin por sub acțiunea câmpului; când nucleotidele trec prin por, reduc secțiunea transversală disponibilă pentru ioni, iar curentul scade [20] .
În funcție de faptul dacă moleculele de acid nucleic secvenționate își păstrează integritatea chimică, există două opțiuni - secvențierea întregii catene și secvențierea exonucleazei [ 21] .
În această metodă, lanțurile de acid nucleic nu sunt scindate. Transferul moleculelor întregi de ADN și ARN prin por poate fi efectuat în următoarele moduri:
În această metodă, lanțul de acid nucleic este tăiat în nucleotide individuale de către o exonuclează situată în imediata vecinătate a porului. Sub acțiunea câmpului, nucleotidele încărcate negativ intră independent în porul unde se determină bazele [21] .
Nanoporii proteici și nanoporii sintetici în stare solidă sunt utilizați pentru secvențiere [21] .
Staphylococcus aureus alfa-hemolizina este un monomer solubil în apă care formează spontan un heptamer în membrană . Domeniul transmembranar constă dintr-o tulpină și un cap de por. Capul porului conține o cavitate de aproximativ 4,5 nm în diametru . La joncțiunea butoiului și a capului, există o îngustare a canalului cu o lățime de 1,5 nm. Tulpina porilor este alcătuită din 14 fire beta antiparalele care formează un canal traversant de aproximativ 2 nm lățime. La pH neutru , multe resturi de aminoacizi din por sunt încărcate (de exemplu, restul de lizină încărcat pozitiv K147 și restul de glutamat încărcat negativ E111). Într-o soluție de KCl 1 M se menține un potențial de 120 mV pe por (de la tulpină la cap), ceea ce determină un curent de 120 pA [22] . Există trei locuri de recunoaștere a nucleotidelor în interiorul tulpinii , ceea ce face posibil, în teorie, ca mai mult de un loc să recunoască o singură nucleotidă (ceea ce mărește acuratețea citirii) [23] .
MSPAPorina A Mycobacterium smegmatis ( ing. Mycobacterium smegmatis porin A, MspA ) este un nanopor cu un diametru de 1,2 nm. Are caracteristici structurale (forma porilor și diametrul) care îmbunătățesc raportul semnal-zgomot în secvențierea ADN-ului în comparație cu alfa-hemolizină [24] . Cu toate acestea, MspA are și un dezavantaj semnificativ: miezul încărcat negativ interferează cu avansarea ADN-ului monocatenar în interiorul porului. Prin urmare, pentru secvențierea în proteina originală, trei resturi de aspartat încărcate negativ au fost înlocuite cu resturi neutre de asparagină [25] .
Proteina de ambalare a ADN-ului motor al bacteriofagului phi29Proteina motor de ambalare a ADN-ului bacteriofagului phi29 este implicată în împachetarea ADN-ului în capside virusurilor, precum și în eliberarea ADN-ului din capside la infecție. Diferența cheie față de proteinele menționate mai sus este că, având un diametru de canal mai mare (de la 3,6 nm la 6 nm), este capabil să treacă ADN-ul dublu catenar. Datorită naturii sale, proteina motorie phi29, spre deosebire de alți pori, nu se integrează în membrană în forma sa originală, dar această problemă este rezolvată prin modificarea proteinei [26] . Alte modificări permit proteinei să ignore ADN-ul monocatenar sau ARN-ul monocatenar [27] .
Pe lângă nanoporii proteici, sunt utilizați și nanoporii în stare solidă nebiologică. Pentru analiza acizilor nucleici, nanoporii sunt utilizați în substraturi din siliciu , nitrură de siliciu și polietilenimină [27] . Porii sunt de obicei arși de fasciculele de ioni sau electroni, ceea ce face ușoară variarea dimensiunii lor [28] . Separat, merită evidențiate materialele care formează pori „2D” foarte subțiri: grafen , disulfură de molibden și altele [27] . Grafenul are, de asemenea, o grosime extrem de mică, ceea ce contribuie la creșterea rezoluției spațiale de-a lungul ADN-ului și, în același timp, rezistență, inerție chimică și conductivitate electrică . Aceste proprietăți facilitează utilizarea acestor materiale în secvențierea nanoporilor [28] .
GrafenFiind o structură subțire și etanșă la ioni, grafenul este un bun material de secvențiere pe bază de nanopori. Astfel, s-a demonstrat că nanoporii de grafen pot fi folosiți ca electrod pentru măsurarea curentului care circulă prin nanopori între două camere care conțin soluții ionice [28] .
Detectare fluorescențăÎn 2010, a fost dezvoltată o metodă de nanosevențiere în stare solidă bazată pe detectarea semnalului fluorescent . În primul rând, ADN-ul dorit este convertit în ADN, în care fiecare bază originală corespunde unei secvențe scurte. Sondele fluorescente ( balize moleculare ) hibridizează pe aceste secvențe scurte , cu capătul unei sonde stingând fluorescența fluoroforului la începutul celeilalte sonde. În același timp, pentru a codifica patru baze, sunt necesare doar două tipuri de sonde: fiecare bază (mai precis, secvența scurtă care îi corespunde) corespunde la două semnale fluorescente (00, 01, 10 sau 11, unde 0 corespunde unuia). culoare, iar 1 la altul). Când trece prin por, ADN-ul dublu catenar rezultat se desfășoară, sonda este separată și, în consecință, fluoroforul de pe următoarea sondă începe să strălucească [29] [30] .
Avantajele metodei includ acuratețea semnalului - camerele înregistrează semnalul mult mai precis decât alte tehnici disponibile. Cu toate acestea, metoda necesită pretratarea probei: conversia fiecărei nucleotide în aproximativ 12 nucleotide (care prelungește și ADN-ul în sine) [29] .
Comparația dintre nanoporii în stare solidă și biologiceNanoporii în stare solidă sunt lipsiți de unele dintre dezavantajele nanoporilor biologici: sensibilitate la pH , temperatură , concentrații de electroliți , stres mecanic etc. În plus, sunt mai stabili, durează mai mult, este mult mai ușor să obțineți o varietate de forme. și dimensiunile acestor pori, iar tehnologia de producție este similară cu producția de semiconductori , ceea ce facilitează foarte mult procesul de obținere a acestor pori și face posibilă combinarea cu alte nanodispozitive. Avantajele nanoporilor biologici includ posibilitatea modificării chimice sau genetice, specificitatea chimică pentru ADN sau ARN și o rată relativ scăzută de trecere a ADN-ului sau ARN prin por [28] [31] .
Pentru a obține nanopori, se poate folosi tehnologia ADN origami . Această posibilitate a fost demonstrată pentru prima dată în 2012, când a fost obținută o structură similară cu alfa hemolizină folosind origami ADN. Structura rezultată încorporată spontan în membrane [27] .
În 2010, s-a demonstrat că nanotuburile de carbon cu un singur perete pot fi, de asemenea, încorporate în membrane și permit trecerea ADN-ului [27] .
Din 2020, nanoporii în stare solidă nu au specificitatea chimică a proteinelor; prin urmare, posibilitatea integrării nanoporilor proteici în substraturi în stare solidă este studiată în mod activ [28] .
O altă direcție promițătoare este utilizarea nanoporilor în stare solidă cu senzori (senzori capacitivi, tunel electronic și alte detectoare) [28] .
În comparație cu metodele de secvențiere existente, utilizarea acestei metode de secvențiere are avantaje [2] , precum costul redus și ușurința în utilizare (datorită absenței necesității de pregătire a probei și utilizarea de reactivi), sensibilitate ridicată (până la secvențiere). fără amplificare ADN din sânge și salivă ), lungime mare de citire (până la zeci de mii de baze), mobilitate ridicată, analiză rapidă și afișare a rezultatelor în timp real [2] .
Dezavantajele includ proprietăți precum calitatea scăzută a citirilor în comparație cu tehnologiile de secvențiere cu citire scurtă (cu toate acestea, această situație se schimbă în bine odată cu apariția de noi algoritmi), pierderea proprietăților funcționale ale porilor biologici în timp (porii funcționează în mod fiabil numai pentru o anumită perioadă de timp).rulări) și influența factorilor de mediu asupra vitezei de citire a secvenței și, în consecință, asupra calității acesteia (o proteină motorie poate funcționa doar la o viteză suficientă într-un anumit interval de pH, deși nu lucrând suficient de rapid în afara intervalului) [32] .
În februarie 2012, la conferința AGBT din Florida , Oxford Nanopore Technologies a prezentat prototipuri a două platforme pentru secvențierea de înaltă performanță a fragmentelor lungi bazate pe secvențierea nanoporilor întregi catene: GridION și MinION. Ca demonstrație, genomul bacteriofag PhiX de 5386 bp a fost secvențiat. [19] Pentru 2020, compania lansează mai multe dispozitive. Toate permit analiza datelor în timp real [33]
MinionMinION este un secvențior de celule de unică folosință de dimensiuni mici, conceput pentru uz casnic, cu un preț țintă de aproximativ 900 USD. Sequencerul are un conector USB 3.0 pentru conectarea la un computer. Conține 512 nanopori cu caracteristici similare [2] . Celula vă permite să secvențați până la 30 de milioane de bp. ADN (în aproximativ două zile se pot digitaliza 10-20 milioane bp de ADN) [34] . În 2019, compania a început să lanseze Flongle, un adaptor pentru MinION sau GridION care vă permite să lucrați cu celule mai puțin productive (~1 Gb, 126 nanopori în loc de 512), dar mult mai ieftine (90 USD) [35] .
GridIONGridION este un dispozitiv proiectat pentru secvențierea întregului genom (în esență un MinION cu debit crescut). Prototipul avea 2000 de nanopori individuali, fiecare capabil să primească citiri de până la 5100 bp lungime. cu o rată de 150 milioane bp/h timp de 6 ore [2] . GridION Mk1 costă 49.955 USD și conține 5 celule independente. Cu ajutorul acestuia, până la 150 de milioane de bp pot fi secvențiate într-un experiment. ADN [36] .
PromethionSequencerul de cea mai înaltă performanță al companiei permite secvențierea mai multor trilioane de bp într-un singur experiment. ADN. PromethION 24 conține 24 de celule și este capabil să digitalizeze 3,8 trilioane bp în trei zile. ADN, PromethION 48 conține 48 de celule și este capabil să digitalizeze 7,6 trilioane bp în trei zile. ADN. Celulele secvențiale conțin 3000 de nanopori [37] . Un flux de date dintr-un astfel de număr de nanopori nu poate fi analizat de un computer convențional, așa că este necesar un supercomputer pentru a utiliza acest secvențior (cu toate acestea, dacă rulați o singură celulă, atunci un computer convențional o poate gestiona) [37] [38] .
Alte evoluțiiCompania intenționează să lanseze încă două dispozitive: SmidgION, un secvențietor care se conectează la un smartphone și Plongle, un secvențietor care conține 96 de celule independente, dar cu debit redus și, în consecință, este conceput pentru secvențierea frecventă a unor cantități mari de ADN scurt. [39] .
Post-procesarea datelor Oxford NanoporeDupă utilizarea produselor Oxford Nanopore, rezultatele sunt date brute în format FAST5. Formatul FAST5 utilizat de Oxford Nanopore este o variantă a standardului HDF5 cu o structură internă ierarhică concepută pentru a stoca metadate și evenimente legate de secvența ADN (măsurători totale de curent total agregate) preprocesate de un dispozitiv de lucru. Rezultatele procesării sunt afișate în timp real în interfața grafică MinKNOW, iar datele sunt înregistrate în format de fișier FASTQ sau .fast5 [40] . Apoi, trebuie să efectuați recunoașterea nucleotidelor ( chemare de bază în limba engleză ). Acest proces va procesa datele brute în format FAST5 în format FASTQ (în MinKNOW, acest proces poate fi pornit în timpul citirii citirilor). De asemenea, puteți utiliza programe precum poreTools [41] , Guppy [42] [43] .
Apoi, trebuie să curățați secvențele primite pentru a scăpa de datele cu prea mult zgomot. Pentru această sarcină, de exemplu, se folosește programul NanoFilt [44] [45] . Odată ce datele au fost curățate, datele rezultate pot fi apoi utilizate pentru colectarea și analiza ulterioară a datelor [43] .
Program ( https://github.com/skovaka/UNCALLED )
Dicționare și enciclopedii |
---|