Fluorescența clorofilei

Fluorescența clorofilei este fenomenul de luminescență a clorofilei atunci când aceasta absoarbe lumina, apare ca urmare a întoarcerii moleculei din starea excitată la starea fundamentală. Este utilizat pe scară largă ca indicator al conversiei energiei fotosintetice în plantele superioare , algele și bacteriile . Clorofila excitată pierde energia luminoasă absorbită, risipindu-o în fotosinteză (conversie a energiei fotochimice sau stingere fotochimică), transformând-o în căldură ca urmare a stingerii non-fotochimice sau emițând-o sub formă de fluorescență. Întrucât toate aceste procese concurează între ele, prin analiza fluorescenței clorofilei, se poate face o idee despre intensitatea fotosintezei și starea de sănătate a plantei [1] .

Efectul Kautsky

După iluminarea frunzelor adaptate la întuneric, poate fi observată o creștere rapidă a fluorescenței Fotosistemului II (PSII), urmată de o scădere lentă. Acest fenomen a fost descris pentru prima dată de H. Kautsky și A. Hirsch în 1931. Efectul a fost numit efectul Kautsky după descoperitorul său.

Creșterea fluorescenței se datorează faptului că centrele de reacție ale fotosistemului II (PSII) intră într-o stare „închisă”. Se spune că un centru de reacție este „închis” atunci când nu mai este capabil să transfere electroni. Acest lucru se întâmplă atunci când purtătorul de electroni din amonte a fost restaurat și nu și-a transferat încă electronii către următorul acceptor de electroni. Închiderea centrelor de reacție reduce eficiența generală a reacțiilor fotochimice (kP) și, prin urmare, crește nivelul de fluorescență (kF). Transferul brusc al frunzei din starea întunecată la lumină crește proporția de centre de reacție PSII închise și duce la o creștere a fluorescenței în primele 1-2 secunde. Mai târziu, fluorescența slăbește încet, acest proces poate continua câteva minute. Scăderea se datorează activării „stingerii fotochimice” și transferului de electroni de la PSII prin ETC de cloroplaste la NADP și ciclului de fixare a carbonului, precum și includerii unor mecanisme de stingere non-fotochimice , care convertesc energia de excitație în căldură. .

Măsurători de fluorescență

Măsurătorile încep cu determinarea nivelului de fond al fluorescenței , care este măsurat prin expunerea frunzei la un fulger scurt de lumină de intensitate scăzută (pentru dispozitivele PAM), insuficient pentru a provoca o reacție fotochimică (toți centrele de reacție sunt deschise) și, prin urmare, conducând complet la fluorescență [2] . $F_{0}$

Pentru a utiliza măsurarea fluorescenței clorofilei pentru a analiza fotosinteza, cercetătorii trebuie să facă distincția între stingerea fotochimică și stingerea non-fotochimică (generare de căldură). Acest lucru se realizează prin oprirea reacțiilor fotochimice, permițând cercetătorilor să măsoare fluorescența doar în prezența stingerii non-fotochimice. Pentru a face acest lucru, planta este puternic iluminată cu un fulger puternic de lumină sau adusă la lumină după adaptarea la întuneric. Există o închidere temporară a tuturor centrelor de reacție PSII și energia nu este transferată de-a lungul lanțului purtător de electroni. Stingerea non-fotochimică nu are efect dacă blițul este suficient de scurt. În timpul unei fulgerări (sau după o expunere bruscă a plantei la lumina din întuneric), centrele de reacție sunt saturate cu lumină cu o tranziție la o stare închisă. În astfel de condiții, când nu există stingere fotochimică, iar nu stingerea fotochimică este neglijabil de mică, fluorescența atinge nivelul maxim, desemnat ca fiind maximul de fluorescență [2] . $F_{m}$

Eficacitatea stingerii fotochimice, care determină eficiența PSII, poate fi evaluată prin compararea cu nivelul staționar de fluorescență în lumină și nivelul de fond al fluorescenței în absența luminii adecvate pentru fotosinteză. Eficiența călirii non-fotochimice variază în funcție de diverși factori interni și externi. Întărirea lui duce la o creștere a degajării de căldură și la o scădere a . Deoarece este imposibil să se oprească complet disiparea energiei termice, este imposibil să se măsoare fluorescența clorofilei în absența completă a stingerii non-fotochimice. Prin urmare, cercetătorii folosesc punctul de adaptare la întuneric ( ) cu care compară valoarea calculată a stingerii non-fotochimice [2] . $F_{m}$ $F_t$ $F_{0}$ $F_{m}$ $F_{m}^{0}$

Parametri generali de fluorescență

$F_{0}$ : Fluorescență minimă (în unități relative). Nivelul de fluorescență în condițiile în care se presupune că toți centrele de reacție sunt deschise (adaptare la întuneric).

$F_{m}$ : Fluorescență maximă (în unități relative). Nivel de fluorescență la fulgerări de intensitate ridicată. Toate centrele de reacție sunt considerate închise.

${F_{0))'$ : Fluorescență minimă (în unități relative) în condiții de adaptare la lumină. Nivelul de fluorescență al probei iradiate, care este redus în comparație cu din cauza prezenței stingerii non-fotochimice. $F_{0}$

${F_{m))'$ : Fluorescență maximă (în unități relative) în condiții de adaptare la lumină. Nivelul de fluorescență al unei probe iradiate cu impulsuri de lumină saturatoare care acoperă temporar toate centrele de reacție PSII.

$F_{tr)$ : fluorescență terminală (în unități relative). Stingerea fluorescenței la sfârșitul testului.

$T_{{1/2}}$ : Jumătate din timpul de creștere de la până la . $F_{0}$ $F_{m}$

Parametri de proiectare

$F_{v)$ : Fluorescență variabilă. Calculat ca = - [3] . $F_{v)$ $F_{m}$ $F_{0}$

${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ : Raportul dintre fluorescența variabilă și fluorescența maximă. Calculat ca . [4] . Este o măsură a eficacității maxime a PSII (dacă toate centrele ar fi deschise). poate fi utilizat pentru a evalua potențiala eficacitate a PSII atunci când probele sunt măsurate în condiții de adaptare la întuneric. ${\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m)))$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

$qP$ : stingere fotochimică. acest parametru oferă o estimare aproximativă a proporției de situsuri de reacție PSII deschise. Calculat ca [5] . ${\frac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ : Eficienţa reacţiilor fotochimice ale fotosistemului II. Calculat ca = [6] . Acest parametru indică proporția de lumină absorbită de PSII care a fost utilizată în reacțiile fotochimice. Ca atare, poate oferi o măsură a ratei de transport liniar al electronilor și, prin urmare, caracterizează întreaga fotosinteză în ansamblu. $Y_{(II)}$ ${\tfrac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ oferă o estimare a eficienței fotosintezei și ne spune ce procese afectează eficiența. Închiderea centrelor de reacție ca urmare a intensității ridicate a luminii va modifica valoarea . Modificările în eficiența stingerii non-fotochimice vor schimba raportul . $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

Utilizare practică

Eficiența fotosistemului II ca măsură a fotosintezei

Fluorescența clorofilei este folosită pentru a măsura nivelul fotosintezei, dar în esență, aceasta este o simplificare excesivă. Fluorescența poate fi utilizată pentru a măsura eficiența fotochimiei PSII, care poate fi utilizată pentru a estima viteza de transport liniar al electronilor prin înmulțirea cu intensitatea luminii. Cu toate acestea, atunci când cercetătorii spun „fotosinteză” înseamnă de obicei fixarea carbonului . Transportul electronilor și fixarea CO 2 au o corelație destul de bună, dar acest lucru poate să nu fie observat în teren din cauza proceselor concurente, cum ar fi fotorespirația , metabolismul azotului și reacția Mehler .

Relația dintre transportul de electroni și fixarea dioxidului de carbon

Pentru a măsura fluorescența clorofilei și schimbul de gaze simultan pentru a obține o imagine completă a modului în care plantele răspund la mediul lor necesită o tehnică de cercetare serioasă și sofisticată. O metodă este măsurarea simultană a reacțiilor fotochimice de fixare a CO 2 și PSII la diferite intensități luminoase în condiții care suprimă fotorespirația . Graficele fixării CO 2 și reacțiilor fotochimice PSII fac posibilă calcularea numărului de electroni necesari pentru asimilarea unei molecule de CO 2 . Pe baza acestei evaluări, este posibil să se estimeze nivelul fotorespirației . Această metodă este utilizată pentru a investiga semnificația fotorespirației ca mecanism fotoprotector în timpul secetei.

Sobradu (2008) [7] a studiat schimbul de gaze și fluorescența clorofilei ca răspuns la intensitatea ridicată a luminii la speciile pionier și forestiere. La prânz s-a măsurat schimbul gazos al frunzelor cu măsurarea nivelului total de fotosinteză și a concentrației intercelulare de CO 2 ( ). În aceleași frunze, au fost măsurați parametrii de fluorescență a clorofilei (fond ; maxim ; și variabil, ). Rezultatele au arătat că, în ciuda faptului că speciile pionier și pădurii provin din habitate diferite, ambele au prezentat o susceptibilitate similară la fotoinhibarea la amiază . $C_{i}$ $F_{0}$ $F_{m}$ $F_{v)$

Măsurarea nivelurilor de stres și a rezistenței

Fluorescența clorofilei face posibilă măsurarea nivelului de stres al plantelor. După nivelul său, se poate aprecia nivelul de expunere la stres abiotic, deoarece temperaturile extreme, iluminarea excesivă și seceta afectează negativ metabolismul plantelor. Aceasta, la rândul său, duce la un dezechilibru între absorbția energiei luminoase de către clorofilă și utilizarea acestei energii în procesul de fotosinteză [8] .

Favaretto şi colab. (2010) [9] au studiat adaptarea la lumină ridicată la speciile pionier și cu succesiune târzie cultivate în condiții de 100% (soare) și 10% (umbră) de lumină normală. S-a constatat că declinul în plină lumină este mai mare la speciile cu succesiune târzie decât la speciile pionier. În general, aceste rezultate indică faptul că speciile pionier cresc mai bine în plină lumină decât speciile de succesiune târzie, sugerând că au o toleranță ridicată la deteriorarea fotooxidativă. ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$
Neocleous și Vasilakakis (2009) [3] au investigat răspunsul zmeurii la stresul cu bor și sare . Folosind un fluorometru, au măsurat , și . Fluorescența clorofilei frunzelor nu depindea semnificativ de concentrația de NaCl atunci când concentrația de bor era scăzută. Când concentrația de bor a crescut, fluorescența clorofilei a frunzelor a scăzut în aceleași condiții de salinitate. Se poate concluziona că efectul combinat al borului și NaCl asupra zmeurii determină un efect toxic, afectând parametrii fotochimici. $F_{0}$ $F_{m}$ $F_{v)$

Indicele echilibrului de azot

Având în vedere relația dintre conținutul de clorofilă și azot din frunze, conținutul de clorofilă poate fi utilizat pentru a detecta deficiența de azot la plante. Există mai multe metode diferite pentru aceasta.

S-a dovedit că este posibil să se judece metabolismul azotului al plantelor după nivelul de polifenoli . Când planta se află în condiții optime, favorizează metabolismul normal și sinteza proteinelor (forma principală de azot biologic), clorofilelor și a unei cantități mici de flavonoide (metaboliți secundari). Pe de altă parte, în cazul deficienței de azot, există o producție crescută de flavonoide [10] .

Indicele de bilanț de azot vă permite să evaluați conținutul de azot în condiții naturale prin calcularea raportului dintre clorofilă și flavonoide.

Măsurarea conținutului de clorofilă

Gitelson (1999) a postulat: „Relația dintre fluorescența clorofilei la 735 nm și în intervalul de lungimi de undă de la 700 nm la 710 nm este liniar legată de conținutul de clorofilă (cu un coeficient de determinare r2 mai mare de 0,95) și astfel poate fi utilizată ca un indicator precis al conținutului de clorofilă din frunzele plantelor. [unsprezece]

Fluorometre

Dezvoltarea fluorometrelor a făcut din măsurarea fluorescenței clorofilei o metodă comună în fiziologia plantelor. O revoluție în analiza fluorescenței clorofilei a fost făcută prin invenția tehnicii de modulare în amplitudine a pulsului (PAM) [ 12 ] [ 13] și apariția primului fluorimetru cu impulsuri comercial sau PAM-fluorimetru PAM-101 (Walz, Germania). ). Prin modularea amplitudinii fasciculului de lumină de măsurare (interval de impuls de microsecunde) și detectarea în paralel a fluorescenței excitate, este posibil să se determine randamentul relativ al fluorescenței (Ft) în prezența luminii împrăștiate. În mod fundamental, aceasta înseamnă că fluorescența clorofilei poate fi măsurată pe teren chiar și sub lumina directă a soarelui [2] .

Unele fluorimetre flash pot determina atât parametrii de lumină, cât și parametrii de adaptare la întuneric (F o , Fm , F o ' , Fm ' , F v / Fm , Y, Ft , F oq ) și pot calcula coeficienți de stingere fotochimică. -stingerea fotochimică (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) și NPQ). Unele fluorometre sunt complet portabile și sunt operate cu o singură mână.

Dezvoltarea unui sistem de imagistică a facilitat determinarea neomogenităților spațiale în probele active fotosintetic. Aceste eterogenități apar în frunzele plantelor, de exemplu din cauza creșterilor, a diferitelor stresuri de mediu sau a unui agent infecțios. Cunoașterea neomogenităților probei este esențială pentru interpretarea corectă a măsurătorilor productivității fotosintetice ale probei. Calitatea ridicată a imaginii oferă posibilitatea de a analiza o singură celulă sau chiar un singur cloroplast, precum și zone care acoperă frunze sau plante întregi.

Abordări alternative

Senzori LIF

Metodele bazate pe efectul Kautsky nu epuizează întreaga varietate de metode de măsurare a fluorescenței clorofilei. În special, progresele recente în fluorescența indusă de laser (LIF) oferă o oportunitate de a dezvolta senzori suficient de compacti și eficienți pentru determinarea stării fotofiziologice și evaluarea biomasei. În loc să măsoare fluxul total de fluorescență, astfel de senzori înregistrează densitatea optică a acestui flux excitat de impulsuri laser puternice în nanosecunde. Această metodă nu necesită 15-20 min de adaptare la întuneric (cum este cazul metodelor bazate pe efectul Kautsky [14] ) și face posibilă excitarea probei de la o distanță considerabilă. Senzorii LIF pot oferi evaluări rapide și la distanță destul de lungă.

Vezi și

Călire non-fotochimică

Note

↑ Lu Congming, Zhang Jianhua. Efectele stresului de apă asupra fotochimiei fotosistemului II și a termostabilității sale în plantele de grâu // Oxford Journals : jurnal. - 1999. - iulie. Arhivat din original pe 16 iunie 2016.
↑ 1 2 3 4 Fluorescența clorofilei — un ghid practic . jxb.oxfordjournals.org (1 aprilie 2000). Data accesului: 28 martie 2011. Arhivat din original pe 23 aprilie 2012.
↑ 1 2 Efectele borului și salinității asupra zmeurii roșii in vitro - International Journal of Fruit Science . Informaworld.com (3 decembrie 2008). Preluat: 28 martie 2011.
↑ Kitajima M., Butler WL Stingerea fluorescenței clorofilei și a fotochimiei primare în cloroplaste de către dibromotimochinonă // Biochim Biophys Acta : jurnal. - 1975. - Vol. 376 . - P. 105-115 . - doi : 10.1016/0005-2728(75)90209-1 .
↑ Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer // Photosynth Res : journal. — Vol. 10 . - P. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 .
↑ Genty B., Briantais JM, Baker NR Relația dintre randamentul cuantic al transportului de electroni fotosintetici și stingerea fluorescenței clorofilei // Biochem Biophys Acta : jurnal. - 1989. - Vol. 990 . - P. 87-92 . - doi : 10.1016/s0304-4165(89)80016-9 .
↑ Sobrado. Caracteristicile frunzelor și variația diurnă a fluorescenței clorofilei în frunzele vegetației „bana” din regiunea Amazonului (engleză) (PDF). (link indisponibil)
↑ Biologia stresului plantelor . personalpages.manchester.ac.uk. Preluat la 6 ianuarie 2017. Arhivat din original la 27 iulie 2017.
↑ Favaretto și colab. Răspunsuri diferențiate ale enzimelor antioxidante la speciile de arbori tropicali pionier și de succesiune târzie cultivate în condiții de soare și umbră : jurnal . - 2011. Arhivat la 19 septembrie 2012.
↑ A. Cartelat, ZG Cerovic, Y. Goulas, S. Meyer, C. Lelarge, J.-L. Prioul, A. Barbottin, M.-H. Jeuffroy, P. Gate, G. Agati, I. Moya. Conținutul evaluat optic de polifenolici din frunze și clorofilă ca indicatori ai deficitului de azot la grâu (Triticum aestivum L. ) : jurnal. — Field Crops Research Volume 91, Issue 1, pages 35-49, 2005. Arhivat din original la 24 septembrie 2015.
↑ Gitelson Anatoly A; Buschmann Claus; Lichtenthaler Hartmut K. Raportul de fluorescență a clorofilei F735/F700 ca o măsură exactă a conținutului de clorofilă în plante // Teledetecția mediului : jurnal. - 1999. - Vol. 69 , nr. 3 . - P. 296-302 . - doi : 10.1016/S0034-4257(99)00023-1 .
↑ Schreiber U., Bilger W. și Schliwa U. Înregistrarea continuă a stingerii fluorescenței fotochimice și non-fotochimice de cloropyhll cu un nou tip de fluorometru cu modulație // Medicamente : jurnal. - Adis International , 1986. - Vol. 10 . - P. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 . Arhivat din original pe 21 iulie 2017.
↑ Schreiber Ulrich. Detectarea cineticii de inducție rapidă cu un nou tip de fluorometru cu cloropyhll modulat de înaltă frecvență // Medicamente : jurnal. - Adis International , 1986. - Vol. 9 . - P. 261-272 . - doi : 10.1007/bf00029749 . Arhivat din original pe 3 iunie 2018.
↑ Handy PEA : Analizor de eficiență a instalației cu excitație continuă . - Norfolk: Hansatech Instruments, 2012. - P. 2. Arhivat 7 aprilie 2016 la Wayback Machine Archived copy (link indisponibil) . Preluat la 26 martie 2016. Arhivat din original la 7 aprilie 2016. (nedefinit)

Literatură

Lazăr. Inducerea fluorescenței clorofilei a // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics : jurnal. - 1999. - Vol. 1412 . - P. 1-28 . - doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x .
Lazăr. Creșterea fluorescenței polifazice a clorofilei măsurată la intensitatea ridicată a luminii excitante // Functional Plant Biology : journal . - 2006. - Vol. 33 . - P. 9-30 . - doi : 10.1071/fp05095 .
Lazăr. Parametrii partiționării energiei fotosintetice (engleză) // Plant Physiology : journal. - Societatea Americană a Biologilor Plantelor , 2015. - Vol. 175 . - P. 131-147 . - doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 .
Kalaji și colab. Măsurători experimentale in vivo ale emisiei de lumină în plante: o perspectivă dedicată lui David Walker // Droguri : jurnal. - Adis International , 2012. - Vol. 114 . - P. 69-96 . - doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 .
Maxwell, K.; Johnson, GN Fluorescența clorofilei--un ghid practic (engleză) // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2000. - Vol. 51 , nr. 345 . - P. 659-668 . doi : 10.1093 / jexbot/51.345.659 . — PMID 10938857 .
Murchie și Lawson. Analiza fluorescenței clorofilei: un ghid pentru bune practici și înțelegerea unor noi aplicații // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2013. - Vol. 64 , nr. 13 . - P. 3983-3998 . - doi : 10.1093/jxb/ert208 .
Heinz Walz GmbH. fluorometru cu cloropilă .